蒙古族人PCSK9基因E670G多态性与冠心病相关性研究

高宇 王春梅 黄志亮 郝淑梦

1.内蒙古林业总医院老年病科，内蒙古自治区牙克石022150；2.黑龙江中医药大学临床医学院，黑龙江哈尔滨150040；3.内蒙古林业总医院心胸外科，内蒙古自治区牙克石022150

蒙古族人PCSK9基因E670G多态性与冠心病相关性研究

高宇1,2王春梅1黄志亮3郝淑梦1

1.内蒙古林业总医院老年病科，内蒙古自治区牙克石022150；
2.黑龙江中医药大学临床医学院，黑龙江哈尔滨150040；
3.内蒙古林业总医院心胸外科，内蒙古自治区牙克石022150

目的探讨PCSK9基因E670G位点多态性与我国蒙古族人群冠心病（CHD）发病的相关性。方法收集2010年10月～2012年10月就诊于内蒙古林业总医院老年病科经冠状动脉造影（CAG）确诊的蒙古族CHD患者60例作为蒙古族CHD组，另选择无血缘关系的蒙古族健康体检者60例（蒙古族健康人群组）、60例汉族CHD患者（汉族CHD组）及60例汉族健康人群（汉族健康人群组）作为研究对象。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术，对PCSK9基因E670G多态性位点的基因型及等位基因进行分析。结果蒙古族CHD组及蒙古族健康人群组的PCSK9基因的3个E670G多态性位点分型结果均符合哈迪温伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律。蒙古族CHD组与蒙古族健康人群组相比突变型杂合子TC、突变型纯合子CC基因型分布频率患CHD的危险度分析OR值分别是野生型纯合子TT基因型分布频率的2.49、2.95倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；蒙古族CHD组C等位基因分布频率明显高于蒙古族健康人群组（58.0%比47.0%），差异有统计学意义（P＜0.05）；汉族CHD组C等位基因分布频率略高于汉族健康人群组（51.0%比48.0%），差异无统计学意义（P＞0.05）。结论蒙古族CHD发病率高可能与PCSK9基因的遗传易感性及E670G多态性位点有关，C等位基因突变增加了患CHD的风险。

蒙古族；冠心病；前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/西布曲明9a型；多态性；相关性

冠状动脉性心脏病（coronary heart disease，CHD）是一种严重影响我国公众健康的主要疾病，其中急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是导致CHD患者死亡的常见原因，近年来其发病率及病死率呈逐年上升的趋势。CHD的发生和发展是一个多因素、多步骤、多基因调节所产生的疾病，包括吸烟、脂质紊乱、种族、环境、遗传等因素，目前国内外研究发现一些遗传易感基因多态性与其发病风险密切相关［1-3］。国内外研究表明，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/西布曲明9a型（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein cholesterol receptor，LDL-R）及胆固醇酯转运蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）基因多态性存在人群缺失多态或突变，与CHD的遗传易感性相关，且具有明显的种族和地域差异［4-5］。目前国内外研究不同种族PCSK9基因多态性与CHD发病的研究较多，国内已有研究均集中在汉族CHD遗传易感性与PCSK9基因多态性的关系的研究，而对蒙古族人群的研究尚未见报道。本研究采用内蒙古地区蒙古族集中聚居优势，对蒙古族群体CHD的遗传易感性与PCSK9基因多态性的关系进行探讨，并与其在汉族人群中的分布进行比较，以期为CHD的发病机制及诊疗提供基础理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2010年10月～2012年10月在内蒙古林业总医院老年病科住院经确诊的蒙古族CHD患者60例（蒙古族CHD组）及同族无血缘关系健康人群60例（蒙古族健康人群组），60例汉族CHD患者（汉族CHD组）及同族健康人群60例（汉族健康人群组）。入选标准：①年龄大于18岁而小于75岁；②病程大于6个月；③冠状动脉造影（CAG）提示主支或主要分支局限性或节段性狭窄大于75%；④心电图提示大于2个导联的ST段的压低或改变；⑤临床症状典型。排除标准：①合并肝肾功能异常；②近期有感染性疾病或甲功异常；③有自身免疫系统疾病；④CAG提示主支或主要分支局限性或节段性狭窄小于30%；⑤临床无症状或心电图提示无异常改变。所有人员均采用EDTA真空抗凝采血针管抽取晨起空腹外周静脉血2 mL各做聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）使用，采血后立即颠倒混匀并转移到-20℃冰箱中保存。蒙古族及汉族CHD患者120例，其中男76例，女44例，平均年龄（61.6±9.8）岁；蒙古族及汉族健康人群120例，其中男81例，女39例，平均年龄（59.4±7.8）岁；两组性别构成比、年龄、吸烟史等比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。以上研究对象为排除PCR扩增失败的样本。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂及仪器DNA快速提取试剂盒、Biometra扩增仪、TANEN凝胶成像分析仪等均购于上海生物工程有限公司。

1.2.2 外周血DNA的制备取高温消毒过的2 mL EP管，取2 mL全静脉血，加入4 mL细胞裂解液，颠倒摇匀，10 000 r/min离心3 min，吸出上清液，保留细胞核沉淀，加入20 μL蛋白酶K溶液，混匀，再加入200 μL GB缓冲液，混匀，56℃水浴10 min，静置10 min，再加入200 μL无水乙醇，混匀，10 000 r/min离心3 min，吸出上清液，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，再次12 000 r/min离心3 min，以增加基因组DNA的获得率。所提取DNA浓度值至0.05 μg/μL，-20℃保存备用。

1.2.3 引物设计①引物设计软件：Primer Premier 5.0及Oligo 6等生物软件；②设计引物序列：上游：5＇-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3＇，下游：5＇-TAGGAG TCTTGTCTCATGCCT-3＇，共计160 bp，各0.4 μmol/L。

1.2.4 PCR扩增与基因分型采用PCR-RFLP技术研究PCSK9基因E670G位点多态性。扩增反应流程：94℃预变性10 min，然后95℃变性40 s；62℃退火40 s；72℃延伸40 s，共36个循环后，72℃继续延伸50 s。PCSK9基因E670G的PCR产物用限制性内切酶进行消化酶切，酶切反应体系总量10 μL，加入10 U E670G限制性内切酶，PCR产物经灭菌蒸馏水7 μL，37℃水浴过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳60 min，电压100 V，使用凝胶成像分析仪分析结果。PCR扩增产物经酶切后产生3种基因型：纯合子型TT（野生型）、纯合子型等位基因CC（突变型）、杂合子基因型TC（杂合型）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析处理，通过直接计数法对基因多态性位点的基因型及频率进行计算，应用LDA及Chromas软件对PCSK9基因E670G多态性位点分型结果进行Hardy-Weinberg平衡定律测定及测序结果进行分析，等位基因和基因型频率分布采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义；用OR和95%CI确定PCSK9基因E670G多态性基因型及等位基因频率与CHD发病的相对危险度。

2 结果

2.1 PCSK9基因E670G多态性检测结果及测序分析

PCR产物经电泳凝胶成像系统摄影记录及测序分析结果如图1、2所示：纯合子型TT（野生型），可见430 bp 1个片段；纯合子型等位基因CC（突变型），可见260 bp及180 bp 2个片段；杂合子基因型TC（杂合型），可见3个片段，分别为430、260 bp及180 bp。

2.2 两组患者PCSK9基因多态性Hardy-Weinberg平衡检测

应用LDA软件对四组测试对象进行PCSK9基因E670G多态性位点Hardy-Weinberg平衡检测，结果如表1、2所示，经χ2检验，均P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究对象来自同一群体，具有较好的代表性。

2.3 四组患者PCSK9基因E670G多态性位点基因型及等位基因频率检验结果比较

蒙古族CHD组与蒙古族健康人群组PCSK9基因E670G多态性位点TT、CC、TC基因型及T、C等位基因的分布频率分别是25.0%、38.0%、40.0%、32.0%、35.0%和30.0%、43.0%、53.0%、58.0%、47.0%。经χ2检验后，蒙古族CHD组和蒙古族健康人群组基因型及等位基因的分布频率差异有统计学意义（χ2=9.819，P=0.002；χ2=5.642，P=0.018）。见表3。

汉族CHD组与汉族健康人群组PCSK9基因E670G多态性位点TT、CC、TC基因型及T、C等位基因的分布频率分别是32.0%、30.0%、30.0%、30.0%、35.0%和37.0%、49.0%、60%、52.0%、48.0%。经χ2检验后，汉族CHD组与汉族健康人群组基因型及等位基因的分布频率差异无统计学意义（χ2=0.527，P= 0.468；χ2=0.254，P=0.614）。见表3。

OR相关性分析结果显示：蒙古族CHD组与蒙古族健康人群组PCSK9基因E670G多态位点突变基因型CC患CHD的危险度是野生型TT的2.95倍，而突变等位基因C可比其他等位基因增加1.78倍，差异有统计学意义（P＜0.05），而汉族CHD组与汉族健康人群组间各基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

所以，蒙古族CHD发病率可能与PCSK9基因E670G多态性位点基因型有关，基因突变增加了患CHD的风险，而汉族CHD发病率与PCSK9基因E670G多态性位点基因型及等位基因分布频率可能无关。

3 讨论

CHD因冠脉粥样硬化等多种原因导致血管管腔狭窄性疾病，是威胁中老年患者健康的主要危险性疾病因素之一。然而，CHD是多因素、多步骤、多基因调节所产生的疾病，特别是单个或多个基因的遗传易感性作用对CHD发病有直接关系［6-7］。美国一项CHD临床研究发现，不同的种族及同种族不同的环境地域对CHD的易感性也有明显的不同［8］。早在20世纪90年代，美国医学界就PCSK9基因E670G多态性位点是否为CHD的遗传易感性以及与性别的差异进行过激烈争论，其中以Saade等［9］为主的大型研究机构认为PCSK9基因E670G多态性位点与CHD的风险相关，而以Werner等［10］和Jelassi等［11］学者的两项研究显示无关联。国内近些年对PCSK9基因也有相关报道，但研究结果也不尽相同，具有代表性的最新报道有广东省的'艳辉等［12］对该地区汉族人群进行了病例对照研究，还有研究者对四川地区CHD与PCSK9基因E670G多态性进行了相关报道［13］，我国台湾人Hsu等［14］认为PCSK9基因影响血脂代谢，但并不是CHD的生物标志物。

内蒙古自治区呼伦贝尔市地处祖国最北端，天气环境条件较为恶劣，除汉族外，蒙古族是人口聚居最多的一个少数民族。本研究结果显示PCSK9基因E670G多态性位点有3种基因型：纯合子型TT（野生型）、纯合子型等位基因CC（突变型）、杂合子基因型TC（杂合型）。PCSK9基因E670G多态性位点的基因型和等位基因频率分布在蒙古族CHD组与蒙古族健康人群组之间有显著性差异，突变基因型CC患CHD的危险度是野生型TT的2.95倍，而突变等位基因C可增加1.78倍；表明蒙古族群体PCSK9基因E670G多态性对CHD具有遗传易感性可能，突变基因型和等位基因频率分布可能增加了CHD的发生风险。而汉族CHD组与汉族健康人群组研究结果显示，PCSK9基因E670G多态性与其发病率无相关性，这与国内部分研究结果相悖，造成结果不同的原因可能是该地区汉族人口较少，环境因素及地区差异也可能是导致该结果的原因。

近些年国内外的多项临床研究发现，PCSK9基因E670G多态性位点位于富含半胱氨酸的C末端，参与对自身催化的调节，若去除该结构域将导致PCSK9的聚集，PCSK9在调节血浆LDL-C水平中具体发挥怎样的作用仍不明了［15-16］。其机制可能是通过转录后机制调节肝脏的LDL-R水平，PCSK9基因过度表达引起肝脏LDL-R的下降，还影响LDL-R介导的LDL-C的摄取，从而影响胆固醇、血浆总胆固醇的水平，导致血浆LDL-C水平升高，所以，PCSK9基因E670G多态性与载脂蛋白、血浆总胆固醇水平等之间存在相关，可作为血浆LDL-C水平及冠状动脉粥样硬化严重程度的独立预测因子，引发CHD发生，并具有剂量效应［17-18］。目前国内外已开始进行Ⅰ期和Ⅱ期药物实验，例如，赛诺菲公司研发的SAR236553和罗氏公司研发的RG7652等，可以说为未来降脂药物的选择提供了新的空间［19-20］。

本实验采用PCR-RFLP方法及病例-对照研究分析PCSK9基因的E670G多态性在不同民族CHD患者分布特点，为CHD的预防和个性化治疗、遗传发病机制、危险性分层评估等提供实验依据。结果显示，PCSK9基因的E670G多态性可能是蒙古族人群CHD发病的遗传危险因素之一，突变基因型CC与突变等位基因C可能增CHD发病风险。CHD患者中突变等位基因C携带者可能与急性冠脉综合征相关。由于存在地区、环境、生活习惯、种族等局限，此结论尚需在后续研究中进一步扩大样本、并采用多种其他分析方法多中心、长期的前瞻性的病例对照研究加以验证，才能真正确定PCSK9基因E670G多态性是否与CHD发生存在内在的联系。

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Relationship between E670G polymorphism of PCSK9 gene and susceptibility to coronary heart disease in the Mongolian nationality

GAO Yu1,2WANG Chunmei1HUANG Zhiliang3HAO Shumeng1
1.Department of Geriatrics,Inner Mongolia Forestry General Hospital,Inner Mongolia Autonomous Region,Yakeshi 022150,China;2.Clinical Medicine College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Heilongjiang Province, Harbin150040,China;3.Department of Cardio-Thoracic Surgery,Inner Mongolia Forestry General Hospital,Inner Mongolia Autonomous Region,Yakeshi022150,China

ObjectiveTo explore the relationship between E670G polymorphism of PCSK9 gene and susceptibility to coronary heart disease(CHD)in the Mongolian people.Methods60 healthy Mongolian people(healthy Mongolian people group),60 Han people with CHD(CHD Mongolian people group);60 healthy Han people(healthy Han people group),and 60 Han people with CHD(CHD Han people group)from October 2010 to October 2012 in Inner Mongolia Forestry General Hospital were collected as study objects.The gene polymorphism of E670G in PCSK9 gene of four groups were detected by PCR-RFLP.Three SNPs in E670G polymorphism of PCSK9 gene(TT,TC,CC)were genotyped by the PCR-RFLP,and the differences of allele frequency and genotype between four groups were analyzed.ResultsNo significant deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium were observed in these three SNPs genotypes in E670G polymorphism of PCSK9 gene(TT,TC,CC)in CHD and healthy peoples(P＜0.05).The distribution frequency of PCSK9-E670G genotypes was significant differences of frequencies were found in genotypes TT,TC and CC between CHD Mongolian people group and healthy Mongolian people group(P＜0.05).The risks of TC and CC for CHD were 2.49 and 2.95 folds respectively to TT genotype,the difference was statistically significant(P＜0.05).The distribution frequency of allele C in the CHD Mongolian people group(58.0%)was statistically higherthan that of the healthy Mongolian people group(47.0%),the difference was statistically significant(P＜0.05);the distribution frequency of allele C in CHD Han people group was higher than the healthy Han people group(51.0%vs48.0%),but there was no statistically significant difference between two groups(P＞0.05).ConclusionGene polymorphism of PCSK9 genotypes may be associated with the risk of Coronary heart disease in the Mongolian nationality but not in Han nationality.The mutation of PCSK9 gene may increase the incidence of CHD in the Mongolian nationality.

The Mongolian nationality;CHD;PCSK9;Polymorphism;Correlation

R541.4［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0018-05

2014-12-12本文编辑：任念）

内蒙古民族大学科学研究项目（编号NMD1349）。

高宇（1980-），女，内蒙古牙克石人，黑龙江中医药大学临床医学专业2013级在读硕士研究生；研究方向：心血管病基础与临床研究。

［作者简介］王春梅（1956-），女，内蒙古牙克石人，硕士生导师；研究方向：心血管病的基因诊断与治疗。