多糖基质蛋白质分子印迹聚合物研究进展

骆薇,张迎庆

(湖北工业大学 食品与制药工程学院，湖北 武汉 430068)



多糖基质蛋白质分子印迹聚合物研究进展

骆薇,张迎庆Δ

(湖北工业大学 食品与制药工程学院，湖北 武汉 430068)

多糖基质分子印迹材料具有良好的生物亲和性、亲水性和胶凝性，并能与模板蛋白形成弱相互作用，是得天独厚的蛋白质分子印迹聚合物材料。文章主要综述了蛋白质分子印迹方法、机理、蛋白质分子印迹聚合物、多糖基质的蛋白质分子印迹的制备及印迹效果评价，并对其应用前景进行了展望。

蛋白质；分子印迹；多糖；聚合物；效果评价

分子印迹技术是基于其印迹聚合物的高度亲和性和特异选择性，从而能够识别特定分子的一种新型技术[1-2]。蛋白质分子印迹聚合物具有对模板蛋白分子的选择性识别能力，蛋白质分子印迹技术在复杂生物大分子混合物的分离纯化、抗体和受体模拟以及仿生传感器等诸多领域具有广阔的应用前景[3]。

1 蛋白质分子印迹技术

1.1 分子印迹技术 分子印迹技术可以定义为通过特定模板导向的聚合物对特定物质的重结合技术[4]。它通常涉及功能单体的共聚、与模板分子的交联以及模板分子的去除过程[5]。当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性[6]。

迄今为止，分子印迹技术已经在小分子如氨基酸、类固醇、碳水化合物、农药、药物、染料、金属离子等不同领域取得成功[7]。

1.2 蛋白质分子印迹 现今对于小分子的印迹在很多领域都取得了成功，技术也相对成熟，但对于生物大分子特别是蛋白质的分子印迹技术仍未有很大的进展。现今蛋白质分子印迹的方法有包埋法、表面印迹法和抗原决定基法，包埋法是最常用的方法。

与小分子印迹相比，蛋白质分子印迹存在以下几个难点：①蛋白质结构复杂易失活，对聚合中的单体、交联剂、引发方式以及识别体系有特殊要求。蛋白质分子上带有电荷或非极性基团，易发生较严重的非特异性吸附；蛋白质为水溶性分子，需要实现水相中聚合及识别，而水的极性很大程度地影响材料与蛋白质分子之间的氢键作用，削弱了印迹效果。②难产生确定的识别位点。高交联度可保证单体材料结合于模板周围形成牢固的识别位点，然而，高交联度会阻止蛋白质大分子自由进出聚合物网络，导致模板分子难以脱除，以及重结合过程中难以进入印迹位点。同时，由于蛋白质为非刚性的生物大分子，需要印迹材料兼有适宜的刚性和柔性，既能形成确定的识别位点，又能与蛋白质分子柔性对接[8-9]。

因而，研究建立高效识别的蛋白质分子印迹体系及对识别机理的探索极具挑战，并对于推进蛋白质分子印迹技术在各领域广泛深入的应用具有重要意义。

2 蛋白质分子印迹机理

深入系统的研究影响蛋白质分子印迹选择性识别效率的机理尚非常缺乏，最迫切需要解决的关键问题是：一方面需要减少非特异性吸附，因蛋白质上带有电荷或非极性基团，易发生的较严重的非特异性吸附。另一方面需增强识别亲和力，这对印迹材料提出了特别的要求。

Verheyen等[10]研究了目前主要的蛋白质印迹基质材料，包括最常用的单体丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸等，以及生物亲和性好的生物分子如壳聚糖、环糊精、琼脂糖等，经结果的分析及重复试验证实：单体和模板间强静电相互作用将导致非常高的非特异性结合，且至今无证据显示，这种强静电相互作用将有利于印迹效果的提高。另一方面也指出，不荷电的印迹基质材料是否是更适宜的高亲和印迹聚合物依然值得探索，因为自然界中，抗原和抗体或者受体与其配体间的高亲和力不仅来源于氢键作用，静电作用和疏水作用也起着重要作用。模板蛋白和材料间的氢键作用虽具非特异性小的优点，但作用力弱，尤其是水溶液中水的极性对其影响很大。如何增强结合亲和力又成为一个大问题。近期的一系列研究也引起了人们的普遍关注。Haupt等[11]以胰蛋白酶为模板和模型酶，在制备胰蛋白酶印迹纳米粒时，功能单体中含有基于其小分子抑制剂氨基苯甲脒的单体，印迹粒子表现出非常高的结合选择性和亲和能力。在此基础上，Zhang等[11]构建了含有苯甲脒的单体的核壳型印迹微球，不仅对模板胰蛋白酶分子有高亲和性，而且由于酶与印迹口袋间强的长距离次级相互作用的形成，显示出比小分子抑制剂高的抑制效果。Liu等[12]将金属离子亲和层析与分子印迹技术相结合，在SiO2球表面固载Cu2+制备核壳型分子印迹微球，采用金属离子作为印迹蛋白质的锚合位点，极大提高了模板蛋白的洗脱效率与重结合能力，同时也为增强模板蛋白与印迹材料间亲和力提供了新的机理。

3 蛋白质分子印迹聚合物

分子印迹聚合物材料是能够识别特定目标分子并能使其从一个复杂混合物中特异地分离出来的高分子材料[13]。丙烯酰胺是最常见的化学印迹功能单体，常与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚形成聚合物，现已有的蛋白质分子印迹大多是用丙烯酰胺作为聚合物材料。另外，3-氨基苯基硼酸、甲基丙烯酸-2-(二甲基氨基)乙酯、4-(乙烯基)苄基亚氨基乙酰乙酸铜和硅烷化试剂如(APTES)和正硅酸乙酯(TEOS)等都能作为聚合物材料[14]。

目前国内外报道的蛋白质分子印迹方法主要围绕着蛋白质模板分子在材料中的传质问题展开。在传统的整体聚合印迹法中，整个蛋白质分子固定在聚合物骨架中，经粉碎后洗脱模板蛋白形成三维印迹孔穴，该法不可避免地会有一定量的模板蛋白残留于材料内部无法洗脱，并存在吸附慢的问题。表面印迹法在聚合物的表面或近表面构造模板蛋白的结合位点，包括各种蛋白质分子印迹膜和表面印迹微球。该法方便了蛋白质分子的洗脱和结合，使分子印迹技术由3D走向2D[15-18]。近年来发展的纳米结构蛋白质分子印迹材料进一步从微米减少至纳米(亚微米)尺度，包括印迹纳米丝、纳米粒、核-壳印迹纳米球等，大大提高了表面积，可显著提高特异吸附容量，进一步提高模板蛋白的传质速度[19-22]。另有抗原决定簇印迹，不用整个蛋白质分子为模板，而以抗原蛋白质能被抗体识别的一小段多肽为模板分子进行印迹，材料通过对多肽的识别而结合抗原蛋白，多肽模板价廉易得，且避免了以整个蛋白质为模板的印迹传质问题，但该法识别效果有待提高，且对识别位点尚不清楚的蛋白不适用[23-24]。

4 多糖基质蛋白质分子印迹聚合物

多糖基质的印迹材料有更好的生物相容性，优良的亲水性和胶凝性，对蛋白质等生物大分子的印迹有着优越的天然条件。和抗体相比，多糖基质的分子印迹材料容易寻找，价格更加便宜，并且储存和运输也更加方便。多糖类具有易于化学改性的特点，可以通过表面接枝的方法连接上其他的功能基团，如壳聚糖和蛋白质有着天然的相容性，并且有着巨大的吸附量，它可以直接作为功能单体也可以作为载体进行包埋。同时多糖基质材料可与模板分子形成氢键弱相互作用，减少非特异性吸附，获得对模板蛋白的高选择性识别。现今研究较多的是壳聚糖，另外，琼脂糖、淀粉、葡聚糖等也都可以作为天然聚合物。所以，对天然印迹聚合物的研究和开发也是今后蛋白质分子印迹的主要研究方向。

4.1 二糖表面蛋白质分子印迹聚合物 有文献报道[25]将蛋白质吸附在亲水的、分子级平坦的云母表面，然后将一个二糖类分子薄层覆盖在吸附的蛋白质上。一经干燥，该糖层便通过大量的氢键与蛋白质络合。随后将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联而沉积。接着去除云母并溶解蛋白质，最终形成一种多糖覆盖的、具有蛋白质形状的纳米凹坑。该方法表现出较好的选择性识别效果。

4.2 壳聚糖基质蛋白质分子印迹聚合物 Li等[26]利用壳聚糖作为功能单体制备出多糖基质的牛血清白蛋白表面分子印迹。他们将高度交联的壳聚糖制成微球，加入牛血清白蛋白后，通过亚胺键共价固定在壳聚糖表面的功能基团上，经模板洗脱后得到能够特异性吸附牛血清白蛋白的壳聚糖微球固定模板。

Yang等[27]用一种简单的方法制备出能够分离溶菌酶的壳聚糖分子印迹。他们将壳聚糖修饰上醛基，以便于蛋白质能够很好地固定在壳聚糖表面，然后通过溶胶-凝胶法引入2种有机硅氧烷，最后洗脱模板，得到壳聚糖印迹。经过吸附实验表明，该分子印迹的吸附容量可以达到15.89 mg/g，并且在混合蛋白溶液中，也能够对溶菌酶表现出很高的选择性。

关怀民等还用壳聚糖制备出血红蛋白分子印迹。将壳聚糖进行改性，制备出羧甲基壳聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生物作为功能单体，再以血红蛋白为模板分子，制备出能识别血红蛋白的分子印迹聚合物。将制得的印迹分子及非印迹分子分别在聚苯乙烯微孔板上进行吸附实验。实验结果表明，该制备出的印迹分子不仅具有很高的对血红蛋白的吸附性，而且在和血红蛋白结构相似物溶菌酶的吸附对比上发现其具有高度的识别特异性[28]。

Wang等[29]用修饰了氨基苯硼酸的壳聚糖作为功能单体，制备出牛血清白蛋白分子印迹。通过平衡吸附实验以及高效液相进行测定的结果表明，制备出的壳聚糖分子印迹具有对模板分子的高度亲和性，并且其吸附可逆性好，即使在恶劣的流动相环境下，依然可以对蛋白质进行很好的分离。

4.3 淀粉基质蛋白质分子印迹聚合物 王红飞等[30]将淀粉进行改性后得到的羧甲基淀粉-氨基苯酚偶联物作为功能单体，牛血清白蛋白为模板，2者混合后搅拌1 h使其混合均匀，然后在过氧化氢和过氧化酶的作用下发生凝胶化反应，得到分子印迹凝胶，用相同的方法制得非印迹凝胶。再分别用2%十二烷基磺酸钠-乙酸溶液进行洗涤直至在紫外278 nm处无吸收峰为止，最后再用大量水洗去残余的洗脱液。经吸附实验表明，印迹和非印迹凝胶均对牛血清白蛋白有一定的吸附作用，但印迹凝胶的吸附容量是非印迹凝胶的2倍。另外，作者用干酪素作为对照检验该分子印迹的选择性，结果表明，该分子印迹对牛血清白蛋白的吸附量远大于对干酪素的吸附量，并且识别的能力与模板分子的用量成正比。

4.4 琼脂糖基质蛋白质分子印迹聚合物 Lin等[31]制备出能够识别牛血清白蛋白和血红蛋白的琼脂糖凝胶膜。他们将琼脂糖用戊二醛进行交联后制成薄膜，然后将模板蛋白印迹在琼脂糖凝胶膜表面。经吸附实验表明，分别与未经印迹的琼脂糖膜相比较，印迹了牛血清白蛋白的琼脂糖薄膜的吸附容量是未经印迹薄膜的3.77～5.72倍，而血红蛋白印迹膜则是1.31～2.18倍，并且牛血清蛋白印迹膜的选择性要高于血红蛋白印迹膜。

4.5 其他 有文献报道了一种新型的蛋白质分子印迹聚合物，将β-环糊精和丙烯酰胺同时作为功能单体，β-环糊精的加入提供了亲水表面和疏水腔，使蛋白质通过氢键相互作用和疏水作用更好的进行模板自组装。实验证明，这种印迹聚合物有效的分离了混合物中的溶菌酶，显示了其高效的选择性[32]。

5 展望

由于分子印迹绑定亲和能力的选择性、容量以及其同质性，分子印迹聚合物还不能提供一个完全替代生物分子的能力[33]。然而，他们潜在的用于分离和传感应用的功能是很清楚的，考虑到他们的低成本和稳定性，分子印迹的前景可以预期在不久的未来。而就目前的国内外研究可知，天然材料作为分子印迹的功能单体具有得天独厚的优势，多糖大分子链上具有许多可供反应的功能性基团(如-OH，-NH2等)，它们可直接与二异氰酸酯、环氧氯丙烷、戊二醛等进行交联反应制得所需聚合物；同时利用这些基团，还易于对所得聚合物进行多种化学修饰；以多糖为基本原料制得的印迹聚合物，具有优良的生物相容性和生物降解性，特别适合用作生物功能材料；多糖来源广泛、可再生，由其制得的分子印迹聚合物成本相对较低。

另外，纳米分子印迹在现如今的研究中成为一个越来越重要的领域，它研究了分子印迹潜在的应用，如生物传感器、固相萃取和生物检测等。纳米分子印迹优于传统的分子印迹聚合物，是因为纳米分子印迹聚合物拥有更高的结合能力，其更大的比表面积对目标物有更大的选择性和亲和性，并且具有对水的高度兼容性。纳米分子印迹聚合物的制备方法主要有沉淀聚合法、微乳液聚合法以及核壳型表面嫁接法等。虽然纳米级分子印迹的制备并非一件容易的工作，但是对它的研究必然是大势所趋[34]。

[1] Verheyen E,Schillemans JP,Van Wijk M,et al.Challenges for the effective molecular imprinting of proteins[J].Biomaterials,2011,32:3008-3020.

[2] Ruigrok VJB,Levisson M,Eppink MHM,et al.Alternative affinity tools:more attractive than antibodies?[J].Biochem J,2011,436(1):1-13.

[3] 高娜.分子印迹技术在蛋白质识别中的应用进展[J].化学研究与应用，2012，24(3)：337-339.

[4] Wulff G.Fourty years of molecular imprinting in synthetic polymers:origin,features and perspectives[J].Microchim Acta,2013,180(15-16):1359-1370.

[5] Ding XC,and Heiden PA.Recent Developments in Molecularly Imprinted Nanoparticles by Surface Imprinting Techniques[J].Macromol Mater and Eng,2014,299(3):268-282.

[6] Lv YQ,Tan TW,Svec F.Molecular imprinting of proteins in polymers attached to the surface of nanomaterials for selective recognition of biomacromolecules[J].Biotech Adv,2013,31(8):1172-1186.

[7] Chen HC,Kong J,Yuan DY,et al.Synthesis of surface molecularly imprinted nanoparticles for recognition of lysozyme using a metal coordination monomer[J].Biosens Bioelectron,2014,53(3):5-11.

[8] Chen L,Xu S,Li J.Recent advances in molecular imprinting technology:current status,challenges and highlighted applications[J].Chem Soc Rev,2011,40(5):2922-2942.

[9] Kryscio DR,Peppas NA.Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers[J].Acta Biomater,2012,8(2):461-473.

[10] Cutivet A,Schembri C,Kovensky J,et al.Molecularly imprinted microgels as enzyme inhibitors[J].J.Am.Chem.Soc,2009,131(41):14699-14702.

[11] Zhang H,Jiang J,Zhang H,et al.Efficient Synthesis of Molecularly Imprinted Polymers with Enzyme Inhibition Potency by the Controlled Surface Imprinting Approach[J].ACS Macro Letters,2013,2(6):566-570.

[12] Liu J,Yang K,Deng Q,et al.Preparation of a new type of affinity materials combining metal coordination with molecular imprinting[J].Chem Commun,2011,47(13):3969-3971.

[13] Piletsky SA,Alcock S,Turner APF.Molecular imprinting:at the edge of the third millennium[J].Trends Biotechnol,2001,19(1):9-12.

[14] 盖青青.分子印迹技术在蛋白质分离和识别中的应用[D].南开大学，2007：4-6.

[15] Lautner G,Kaev J,Reut J,et al.Selective Artificial Receptors Based on Micropatterned Surface-Imprinted Polymers for Label‐Free Detection of Proteins by SPR Imaging[J].Adv Funct Materials,2011,21(3):591-597.

[16] Wu S,Tan W,Xu H.Protein molecularly imprinted polyacrylamide membrane:for hemoglobin sensing[J].Analyst,2010,135(10):2523-2527.

[17] Gai Q,Qu F,Liu ZJ,et al.Superparamagnetic lysozyme surface-imprinted polymer prepared by atom transfer radical polymerization and its application for protein separation[J].J Chromatog A,2010,1217(31):5035-5042.

[18] Wang YT,Zhang ZQ,Jain V,et al.Potentiometric sensors based on surface molecular imprinting:Detection of cancer biomarkers and viruses[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2010,146(1):381-387.

[19] Cai D,Ren L,Zhao H,et al.A molecular-imprint nanosensor for ultrasensitive detection of proteins[J].Nat Nanotechnol,2010,5(8):597-601.

[20] Chen T,Shao M,Xu H,et al.Molecularly imprinted polymer-coated silicon nanowires for protein specific recognition and fast separation[J].J Mater Chem,2012,22(9):3990-3996.

[21] Gao R,Kong X,Wang X,et al.Preparation and characterization of uniformly sized molecularly imprinted polymers functionalized with core-shell magnetic nanoparticles for the recognition and enrichment of protein[J].J Mater Chem,2011,21(44):17863-17871.

[22] Ambrosini S,Beyazit S,Haupt K,et al.Solid-phase synthesis of molecularly imprinted nanoparticles for protein recognition[J].Chem Commun,2013,49(60):6746-6748.

[23] Bossi AM,Sharma PS,Montana L,et al.Fingerprint-imprinted polymer:rational selection of peptide epitope templates for the determination of proteins by molecularly imprinted polymers[J].Anal Chem,2012,84(9):4036-4041.

[24] Lu CH,Zhang Y,Tang SF,et al.Sensing HIV related protein using epitope imprinted hydrophilic polymer coated quartz crystal microbalance[J].Biosens Bioelectron,2012,31(1):439-444.

[25] Shi H,Tsai WB.Garrison MD,et al.Template-imprinted nanostructured surfaces for protein recognition[J]．Nature.1999,398(6728):593-597.

[26] Li F,Li J,Zhang SS.Molecularly imprinted polymer grafted on polysaccharide microsphere surface by the sol-gel process for protein recognition[J].Talanta,2008,74(5):1247- 1255.

[27] Yang S,Wang YZ,Xu ML,et al.Synthesis of modified chitosan-based molecularly imprinted polymers for adsorptive protein separation[J].Analytical Methods,2013,5(20):5471-5477.

[28] 关怀民，童跃进. 壳聚糖基蛋白质分子印迹聚合物的制备及识别性能研究[J].福建师范大学学报(自然科学版)，2010，26(1)：73-77.

[29] Wang HF,He YH,He XW,et al.BSA-imprinted synthetic receptor for reversible template recognition[J].Journal Sep Sci,2009,32(11):1981-1986.

[30] 王红飞.多糖基分子印迹功能材料的研究[D].中山大学，2010：30-47.

[31] Lin Y,Tang S,Mao X,et al.Protein recognition via molecularly imprinted agarose gel membrane[J].J Biomed Mater Res,2008,85(3):573-581.

[32] Zhang W,Qin L,He XW,et al. Novel surface modified molecularly imprinted polymer using acryloyl-β-cyclodextrin and acrylamide as monomers for selective recognition of lysozyme in aqueous solution[J].Journal of Chromatography A, 2009,1216(21): 4560-4567.

[33] Fukazawa K,Li Q,Seeger S,et al.Direct observation of selective protein capturing on molecular imprinting substrates[J].Biosens Bioelectron,2013,40(1):96-101.

[34] Poma A,Turner APF,Piletsky SA.Advances in the manufacture of MIP nanoparticles[J].Trends Biotechnol,2010,28(12):629-630.

(编校：王俨俨)

Research progress of polysaccharide-based protein molecular imprinting polymers

LUO Wei,ZHANG Ying-qingΔ

(Food and Pharmaceutical Engineering College, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

The polysaccharide-based protein molecular imprinting polymers have good biological compatibility, hydrophilic and gelling property, and can form weak interaction with template proteins, are the unique protein molecularly imprinted polymer materials.The method and mechanism of the protein molecularly imprinting, the protein molecularly imprinted polymers, the preparation and evaluation of imprinting effects of polysaccharide-based protein molecular imprinting polymers and its application prospect have been reviewed in this paper.

protein; molecularly imprin; polysaccharides; polymers; effects evaluation

骆薇，女，硕士在读，研究方向：生物制药，E-mail：willluowei@163.com；张迎庆，通讯作者，女，博士，教授，研究方向：生物制药，E-mail：yingqingzhang@163.com。

Q53

A

1005-1678(2015)02-0177-04