甾体激素受体辅激活子-2对子宫内膜异位症患者孕酮抵抗的作用研究

常玉华,刘香环,李坤

(1.山东省交通医院 妇产科，山东 济南 250031；2.山东省医学科学院附属医院 妇产科，山东 济南 250031)



甾体激素受体辅激活子-2对子宫内膜异位症患者孕酮抵抗的作用研究

常玉华1,刘香环1,李坤2

(1.山东省交通医院 妇产科，山东 济南 250031；2.山东省医学科学院附属医院 妇产科，山东 济南 250031)

目的 通过检测子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)患者异位内膜和正常子宫内膜中孕酮受体(progesterone receptor，PR)和甾体激素受体辅激活子-2(steroid receptor coactivator-2，SRC-2)的表达，探讨SRC-2对EMs患者孕酮抵抗的作用。方法 随机选取2013年6月～2014年5月间在山东省交通医院妇产科行腹腔镜或开腹手术的EMs患者45例(异位内膜组)和35例因子宫肌瘤行子宫切除术患者非瘤区对照子宫内膜组织(对照内膜组)。采用反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)和免疫组化检测异位内膜组和对照内膜组中PR和SRC-2的表达，并进行比较。结果 PR和SRC-2在异位内膜组中的表达显著低于对照内膜组(P<0.05)；对照内膜组中PR和SRC-2的表达在增生期增强，并随着分泌期逐渐减弱，在整个月经周期中存在周期性变化，有统计学差异(P<0.05)；异位内膜组中PR和SRC-2的表达在增殖期和分泌期比较，无周期性变化，差异无统计学意义。结论 SRC-2可以调控PR基因的转录反应，促进靶基因的转录和蛋白表达，其表达下降可导致子宫内膜PR的表达改变，从而显著消减子宫PR对孕酮的反应性。

子宫内膜异位症；甾体激素受体辅激活子-2；孕酮受体；孕酮抵抗

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是育龄期的妇女常见的多发病。据相关文献报道，育龄期妇女患EMs的比例已经高达6%～10%[1]。而对于那些患有慢性盆腔痛或是不孕症的育龄妇女，其患EMs的比例更是高达45%～50%[2]。异位内膜周期性出血形成的病灶会导致育龄期女性不孕及严重的慢性疼痛[3]。孕酮是拮抗雌二醇(estradiol，E2)的经典药物，其可通过与受体结合介导信号传导从而调控基因表达，抑制异位内膜的生长和炎性反应[4]。很多孕酮类药物在临床上用来缓解和控制EMs患者的症状。然而，虽然EMs患者的血清孕酮水平正常，但是其整个生殖系统对孕酮的反应性失调，表现为EMs患者对孕酮治疗呈现低反应和无反应，这一现象被称为“孕酮抵抗”[5]。目前国内外的研究表明，孕酮抵抗可能与甾体激素受体辅激活子(steroid receptor coactivator，SRC)等有关[6]。通常这些受体辅激活子蛋白以配体依赖性的形式与雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)结合，从而激活相关靶基因的转录和蛋白的表达[7]。近年来更多的研究表明[8]，SRC-2在调节PR功能上发挥着十分重要的作用。SRC-2是转录因子与顺式作用元件(包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控)之间的“桥梁”蛋白，以多蛋白复合体的形式存在于细胞内，可以调控一系列基因的转录反应，并最终促进靶基因的转录和相关蛋白的表达[9-10]。为了进一步探讨SRC-2对子宫内膜异位症患者孕酮抵抗的作用，本课题随机选取2013年6月～2014年5月间在山东省交通医院行腹腔镜或开腹手术的EMs患者45例和正常对照组35例，观察ER、PR和SRC-2在EMs患者异位内膜组织和正常对照组在位内膜组织的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2013年6月～2014年5月间在本院行腹腔镜或开腹手术的EMs患者45例(异位内膜组，EMs组)和35例因子宫肌瘤行子宫切除术患者非瘤区对照子宫内膜组织(对照内膜组)作为研究对象。年龄35～52岁，平均(43.53±9.55)岁。2组患者术前6个月内均未行激素或者抗子宫内膜异位症的药物治疗，此外没有内科合并症，而且月经周期正常26～31 d。本实验获得患者知情同意，且得到本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和试剂盒 Trizol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；M-MuLV反转录酶(美国NEB公司)；5 U/μLTaq DNA聚合酶(广州东盛生物科技有限公司)；兔抗人PR单克隆抗体(美国DAKO公司)，工作浓度1:100；兔抗人SRC-2单克隆抗体(美国DAKO公司)，工作浓度1:100；二抗为羊抗兔免疫球蛋白(上海通派生物科技有限公司)，工作浓度1:100。

1.3 方法

1.3.1 样本收集：样本收集参考信聪伶等[11]方法。

1.3.2 RT-PCR扩增PR和SRC-2：引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列为：PR上游：5’-AGCCGGTCCGCGTCC-AAG-3’下游：5’-CCACCCAGAGCCCGAGGG-3’SRC-2上游5’-GCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAG-3’下游5’-GTGGAGGAACTCTG-GGAATGTG-3’。具体实验操作按照RT-PCR试剂盒的说明进行，反应体系为50 μL，94 ℃下先预变性4 min，然后按照94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，反复进行30个循环，最后在72 ℃下延伸10 min。

1.4 结果判断

1.4.1 扩增产物的鉴定：取RT-PCR的产物10 μL，置于2%的琼脂糖凝胶中电泳，相对分子质量标准采用pUC Mix Marker，以目的基因光密度与β-actin基因光密度的比值来确定。

1.4.2 免疫组化检测结果判断：选择包含异位腺上皮和间质细胞的高倍镜视野进行观察，随机计数60个腺上皮和间质细胞，然后按照着色程度和着色的百分比来评分。得分标准：弱表达为1分，中度表达为2分，强表达为3分，无表达为0分，半定量得分=Σ阳性细胞的染色强度×阳性细胞的百分数。

2 结果

2.1 2组子宫的内膜组织PR mRNA和SRC-2 mRNA表达比较 由图1可知，子宫内膜异位组中PR和SRC-2的mRNA的表达显著低于对照内膜组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 2组子宫内膜组织中PR和SRC-2mRNA比较*P<0.05，与对照组相比，Fig.1 Comparison of PR and SRC-2 mRNA expression of endometrial tissue between two groups*P<0.05，compared with control group

2.2 PR mRNA和SRC-2 mRNA在不同月经周期中的比较 如图2所示，PR mRNA和SRC-2 mRNA在对照组中增殖期和分泌期表达的水平有显著性差异(P<0.05)。而PR mRNA和SRC-2 mRNA在EMs组中增殖期和分泌期表达水平没有统计学差异。

图2 2组子宫内膜组织中PR和SRC-2 m RNA在不同月经周期中的比较*P<0.05，与增殖期相比Fig.2 Comparison of mRNA between PR and SRC-2 in different menstrual cycles of two groups*P<0.05， compared with proliferative phase

2.3 PR蛋白和SRC-2蛋白在子宫内膜组织中比较 由图3可知，子宫内膜异位组中PR和SRC-2的细胞核内可见明显的棕黄色染色现象，表达呈现强阳性；在对照组中呈现出较弱染色，表达呈现弱阳性。结果表明，子宫内膜异位组中PR和SRC-2的蛋白表达显著低于对照内膜组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 EMs组和对照组PR蛋白和SRC-2蛋白的表达比较Fig.3 Comparison of PR and SRC-2 protein expression between control group and EMs group

3 讨论

近年来更多的研究表明[12]，SRC-2在调节PR功能上发挥着十分重要的作用。SRC-2是转录因子与顺式作用元件(包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控)之间的“桥梁”蛋白，以多蛋白复合体的形式存在于细胞内，可以调控一系列基因的转录反应，并最终促进靶基因的转录和相关蛋白的表达[13-14]。当PR与孕酮结合后，其构型发生改变形成二聚体，该二聚体再通过有序的募集包括SRC家族在内的辅激活子来实现对靶基因转录的调节[15]。

SRC是最早发现的一类核受体辅激活子，包括SRC-1、SRC-2和SRC-3。其中SRC-2是子宫PR的优势辅激活子，在子宫内膜和平滑肌细胞上的表达与PR具有时间和空间的一致性[16]。研究发现，SRC-2表达缺失可抑制PR介导的子宫内膜发生脱模样变化。此外，PR正常的SRC-2基因敲除小鼠患有严重的生育功能缺陷。本研究也显示，异位症内膜组的PR和SRC-2的mRNA表达和蛋白表达均呈阴性，而对照组内膜的PR和SRC-2的mRNA和蛋白表达均呈阳性，而且2组的mRNA和蛋白表达量也不同，子官内膜异症患者mRNA和蛋白表达均低于对照组。以上研究表明子官内膜异位症患者存在PR的表达异常，而SRC-2是子宫PR的优势辅激活子，SRC-2的表达下降会显著消减子宫PR对孕酮的反应性。这可能就是子宫内膜异位症患者孕酮抵抗现象的主要分子机制。

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(编校：谭玲)

Study on effect of steroid receptor coactivator-2 on progesterone resistance in patients with endometriosis

CHANG Yu-hua1,LIU Xiang-huan1,LI Kun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Traffic Hospital of Shandong Province, Jinan 250031, China; 2.Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Science, Jinan 250031, China)

ObjectiveTo investigate effect of SRC-2 on progesterone resistance by detecting the expression of progesterone receptor and steroid receptor coactivator-2 in ectopic endometrium of patients with endometriosis and normal endometrium in control group.Methods45 cases of endometriosis patients admitted in department of obstetrics and gynecology of traffic hospital from June 2013 to May 2014 were selected as endometriosis group，and 35 cases ocontrol endometrial tissues in non-tumour region in patients with uterine fibroids who had a hysterectomy as control endometrium group.The expression of PR and SRC-2 in endometriosis and control group were detected by reverse transcription-PCR and immunohistochemistry.ResultsExpression of PR and SRC-2 in endometriosis group were significantly lower than control groups (P<0.05)；expression of PR and SRC-2 were enhanced in the proliferative phase and gradually weakened along with the secretory phase，existed cyclical variation in menstrual cycle,the difference had statistically significant (P<0.05)；expression of PR and SRC-2 had no periodic variation in the proliferative and secretory phase,the difference had no statistically significant.ConclusionSRC-2 could regulate transcription reaction of PR genes to promote transcription and protein expression of a target gene,its decreasing expression may lead to the changes of expression in the endometrium PR,PR significantly reduction of uterine progesterone reactivity.

endometriosis; steroid receptor coactivator-2; progesterone receptor; progesterone resistance

山东省自然科学基金(ZR2009CL027)；济南市科技局科技明星计划(20100118)；山东省医学科学院医学基金(201023)

常玉华，女，本科，主治医师，研究方向：妇产科学，E-mail：qch1821460008@163.com。

R711

A

1005-1678(2015)02-0146-03