DACT1基因甲基化在鼻咽癌细胞侵袭中的作用

张松 余坤飞 熊武 袁佛良 吴淑献 潘松 周军

DACT1基因甲基化在鼻咽癌细胞侵袭中的作用

张松 余坤飞 熊武 袁佛良 吴淑献 潘松 周军

目的探讨DACT 1基因甲基化状态在鼻咽癌细胞侵袭中的作用。方法采用甲基化特异性PCR及RT-PCR检测CNE2细胞在S-腺苷-L-甲硫氨酸处理前后DACT1基因的甲基化状态及其表达情况,用transwell小室法观察S-腺苷-L-甲硫氨酸对CNE2细胞侵袭的影响。结果未经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE2细胞中DACT1基因非甲基化,DACT1高表达,S-腺苷-L-甲硫氨酸处理后DACT 1基因高甲基化,DACT 1不表达,且CNE 2细胞侵袭受抑制。结论DACT 1基因甲基化状态与其表达有关,可能在鼻咽癌细胞侵袭中起重要作用。

DACT1基因；鼻咽癌；CNE2细胞系；侵袭

最近研究发现,DACT 1(Dapper1/Dpr1)基因是一个肿瘤相关基因,其在调节肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移中起重要作用。有研究提示,在非小细胞肺癌中DACT 1的表达与肿瘤病理分级、大小、侵袭及转移有关。鼻咽癌中DACT 1的表达情况及其与鼻咽癌的发生、发展及转移的关系还未见报道。本研究将通过改变DACT 1甲基化状态改变其表达情况,观察DACT 1基因在鼻咽癌细胞侵袭中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 CNE2细胞购于中国生命科学院上海细胞所,在5％二氧化碳、37℃的条件下,用含10％胎牛血清的1640培养基培养。在细胞处于对数生长期时用胰蛋白酶消化后分离CNE 2细胞,然后以等量接种在六孔板上,第2天,将六孔板中的6孔随机分为两组,一组用S-腺苷-L-甲硫氨酸处置,另一组不加任何药物,药物作用1 d后更换培养基继续培养,2 d后收获细胞用于后续实验。

1.2 甲基化特异性PCR 上述细胞收获后用DNA提取试剂盒提取各组细胞的DNA,然后用DNA甲基化试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰,根据GeneBank中DACT 1基因序列用甲基化引物设计软件分别设计甲基化和非甲基化引物序列。甲基化引物序列(M)：5-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3(S),5-CGCTAAAACTACGACCGCG-3(R),非甲基化引物(U)：5-GTT GGGATAGTAGTAGTTGGT-3(S),5-AAACACTAAAACTACA ACCACA-3。分别用两种引物对上述亚硫酸盐修饰的各组细胞的DNA进行扩增,退火温度分别是60℃(甲基化)和58℃(非甲基化)。分别取PCR产物10 μl用2％琼脂糖凝胶电泳,观察DACT 1基因甲基化情况。

1.3 RT-PCR 采用TRIzol 试剂提取上述细胞的总RNA,用逆转录酶进行反转录形成DNA第一链(cDNA)。根据GeneBank中基因序列分别设计DACT 1和β-actin两对引物,分别以cDNA为模板行PCR。DACT 1引物：5-GGAAGAGGACAG GCTTGGAAAC-3(S),5-GTCCCATTGTTCAGAGAAGGTATC-3(R)；β-actin引物：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3,5-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3,退火温度均是60℃。反应结束后取PCR产物5 μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳,观察DACT 1表达情况。

1.4 细胞侵袭实验(transwell小室法) 将对照和加药处理24 h的细胞消化制成105个/ml悬液,取1 ml 细胞悬液于1500 rpm离心5 min,弃上清。加入200 μl 无血清培养基,吹打均匀后放入transwell小室中。 Transwell板中加入500 μl含10％ FBS 1640的完全培养基,将小室放入板中。37℃下于5％ CO2培养箱中培养24 h。将小室取出,用PBS洗去培养基,结晶紫染色10 min,自来水将表面的结晶紫洗除干净,用棉签将上室中的细胞擦除干净,于倒置显微镜下观察,每组细胞随机取10个视野记录细胞数,分析观察两组细胞侵袭能力。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(％)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

甲基化特异性PCR结果显示,未经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1基因是非甲基化的,而经过S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1基因是甲基化的,这说明S-腺苷-L-甲硫氨酸能使非甲基化的DACT 1基因重新甲基化。

RT-PCR结果提示,在未经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1高表达,而在经过S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1不表达,这说明S-腺苷-L-甲硫氨酸通过改变DACT 1基因的甲基化状态而改变了其表达。

transwell小室实验结果显示,未经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞侵袭数(χ2=13.50±2.15)明显多于经过S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞侵袭数(χ2=8.50±1.08,t=5.868,P＜0.001)。这说明DACT 1的表达情况影响CNE 2细胞的侵袭能力。

3 讨论

DACT 1基因定位于14q22.3,其编码836个氨基酸的蛋白质,氨基端有1个亮氨酸连接区域,羧基端有1个PDZ连接位点。最近研究发现,其是1个肿瘤相关基因,其可能通过增强Bata-连环蛋白的表达,影响Wnt信号转导途径,调节细胞周期及凋亡,进而调节肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移。Yuan等［1］研究发现,DACT 1在结肠癌细胞中的高表达能促进癌细胞的生长、增殖、迁移及侵袭能力。有研究认为［2］,在B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞中DACT 1的高表达与其基因低甲基化有关。

DNA甲基化是基因表观遗传学修饰的一种重要方式,即在DNA序列不变的情况下调节某些特定基因组区域的转录活性,控制该基因的表达［3］。基因启动子区CpG岛甲基化状态与基因的活性有关,启动子区域CpG岛高甲基化是基因失活的主要原因之一。先前研究发现,抑癌基因DAPK及肿瘤转移相关基因uPA的表达与其基因启动子区CpG岛甲基化状态有关,且这些基因的甲基化状态是可逆的,可通过调节某些酶的活性改变这些基因的表达,进而影响鼻咽癌及喉癌细胞的生长及侵袭能力［4］。本研究结果显示未经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1基因启动子区非甲基化,DACT 1高表达,而经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1基因启动子区高甲基化,DACT 1不表达,且CNE细胞的侵袭能力明显减弱。说明S-腺苷-L-甲硫氨酸在DNA复制过程中能使去甲基化的基因重新甲基化而失去表达,根据失活基因的功能而调节细胞的生长及侵袭,进而在肿瘤生长、侵袭及转移中起重要作用。

综上所述,DACT 1基因甲基化状态与其表达有关,可以通过改变其甲基化状态改变其表达,进而调控肿瘤细胞的生长及侵袭,进而调节肿瘤的进展。

［1］Yuan G,Wang C,Ma C,et al. Oncogenic Function of DACT 1 in Colon Cancer through the Regulation of b-catenin. Plos One,2012,7(3):1-17.

［2］Kong WJ,Zhang S,Guo CK,et al. Effect of methylationassociated silencing of the deathassociated protein kinase gene on nasopharyngeal carcinoma. Anti-Cancer Drugs,2006,17(3):251-259.

［3］张松,李烁,高春生. uPA基因启动子区低甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用.肿瘤防治研究,2012,39(6):691-693.

［4］叶星星,蔡志毅,陈佳玉,等.细胞周期素G在鼻咽癌细胞中的表达及其意义. 中国卫生检验杂志,2010(11):165-166.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.24.218

2015-08-20］

深圳市卫生和计划生育委员会资助项目(项目编号：201302227)

518106 深圳市光明新区人民医院耳鼻咽喉科