禾谷类花粉培养的生物学基础研究进展

戴 力，王学华

（湖南农业大学农学院，长沙　410128）

禾谷类花粉培养的生物学基础研究进展

戴 力，王学华*

（湖南农业大学农学院，长沙410128）

从植物生理代谢的角度总结禾谷类花粉培养中一系列过程的生理代谢机制，同时探讨了小孢子脱分化和愈伤组织形成、分化及转化等几个关键过程的生理学或细胞学机制。对该领域当前面临的问题和未来发展的方向进行了总结和展望。

禾谷类作物；花粉培养；脱分化；愈伤组织；生理生化机制

由于在育种实践和基因工程操作等方面存在巨大优势，植物花药、游离花粉（小孢子）培养获得单倍体植株的技术自20世纪六七十年代开始备受关注。特别是在当今追求高效的商业化育种中，其快速纯合、大大缩短育种周期以及选择效率高的重要特性便显得尤为突出。游离花粉培养可生产大量单倍体（Haploid）和加倍单倍体（Doubled Haploid，DH群体），进一步获得纯系，为外源基因的导入提供良好的受体；而DH群体又可为形态发生学、遗传学和发育分子生物学等基础研究提供遗传背景多样且稳定的材料。除此之外，花粉培养还可作为细胞的分裂诱导和全能性、花粉发育途径转换及其调控等研究的理想实验体系［1，2］，促进这些方面理论研究的发展。因此，花粉培养理论与技术研究非常必要。

就其本质而言，花粉培养其实就是特殊（单倍体）单细胞的培养，是具有一定分化程度的单倍体花粉细胞经过脱分化和再分化形成完整的单倍体花粉植株的过程。它相对于花药培养技术来说，具有不可替代的优势［3，4］。因此，尽管花粉培养比花药培养的技术难度更大，然而近年来人们对它的研究却并没有减少。花粉细胞脱分化和再分化的实质就是基因在一定环境条件下的选择性表达，即细胞全能性的表现。这从理论上说明各种基因型的花粉细胞在一定的内外条件下都能够通过花粉培养得到花粉植株。当前实践中仍有较多植物或品种未培养获得花粉植株或者诱导率很低，其可能的原因是还未找到与其基因型相配套的最适培养条件。对于不同作物或同一作物不同品种的花粉，其培养条件的适宜性可能主要取决于花粉本身及在培养过程中的遗传和生理生化特性。其中，生理生化特性既是遗传与表型之间的重要纽带，又对实践性研究与生产具有重要的理论指导作用。研究花粉培养的生理生化机制，首先要了解其生物学基础。

禾谷类作物作为全球主要的粮食作物，随着世界人口的增长和农业生产面临耕地面积减少、全球气候变化等挑战，对其进行特异性的遗传改良与育种并加快优良品种育成速度愈发重要。游离花粉培养技术是达到这一目的的一条重要途径。随着生物技术的不断发展，近年来国内外在该培养技术方面的研究取得了较大进步。为此，笔者拟综述水稻、玉米、小麦、大麦等主要禾谷类作物花粉培养的生物学基础及其过程中的生理生化和遗传机制，以期有助于禾谷类作物花粉培养技术的进一步发展。

1　花粉细胞的类型及发育途径

在高等植物花器官中，花粉母细胞经两次减数分裂后形成小孢子（microspore），再分裂形成生殖细胞和营养细胞后即为雄配子体。在花粉培养中通常将小孢子和雄配子体统称为花粉（pollen）。根据花粉细胞中核数目的多少可将其发育过程依次分为:单核早期、中期和晚期及第一次核有丝分裂期、双核期、第二次有丝分裂期和花粉成熟期等几个阶段。小孢子有广义和狭义之分。狭义的小孢子包括四分体解体到第一次核有丝分裂时期的细胞，广义的小孢子包括双核期的花粉，即通常花粉培养中所说的小孢子［5］。

王志武等［6］研究发现，大麦小孢子群体中存在有活力和无活力（衰败）小孢子共存的现象，被称为花粉二态性或二型性（Pollen dimorphism）。这两类小孢子最早出现于单核中晚期（ML）；区别较明显:前者直径随发育推进而渐增，在普通光源下，呈现出直径大、细胞质丰富和外形近圆形；后者从单核晚期到成熟期之间细胞大小增长十分缓慢，直径明显小于前者，胞质缺乏，染色较浅，外壁皱缩。Ming T Chang于1989年在玉米中也进行了类似的报导。二态性现象很好地解释了密度梯度离心处理对小孢子离体培养的重要作用——对新取材的或经一定前处理后的花粉进行离心纯化，可以提高活力小孢子在接种小孢子中的比例，从而提高花粉培养的效率和遗传转化率。

根据花粉发育途径的不同或在离体培养中分裂能力的有无，活力小孢子可分为胚性和非胚性两种。小孢子的发育可塑性很大，可因内在生理及外界环境的变化而朝不同方向发育。总的来说，共有三种可能发育途径［7］:①（雄）配子体发育途径。小孢子发育的一般途径——发展得到雄配子体，此类小孢子在离体培养中不能分裂形成多细胞花粉（multicellular pollen），通常培养一段时间后便退化死亡，因此被称为非胚性花粉。②孢子体发育途径。又称“雄核发育途径”，发育形成再生单倍性孢子体植株。这类小孢子因能在培养中分裂形成多细胞花粉并进一步分裂分化出单倍体植株而被称为胚性花粉。③雌配子体发育途径。小孢子发育出类似雌配子的构造，转换为雌性配子体的途径，这种途径只在极其少见的特殊情况下出现，因此常被忽略。胚性小孢子较非胚性小孢子体积增大，具有中央大液泡和清晰的细胞质［8］，在细胞质中出现无细胞器区域，淀粉粒和脂质体数量和大小急剧下降，且核糖体和细胞器总量下降［9，10］；表现为细胞质脱分化程度增大，有研究者称之为细胞质重组，并认为它与胚胎诱导潜力有关［11］。

Clément等［10］报道认为，小孢子早在减数分裂期便已开始发生细胞质重组。在真核细胞中，已知的可引起细胞质重组的路径有两种:泛素-26S蛋白酶系统——短命和长命分子退化的主要细胞途径；细胞的自我吞噬作用——细胞器通过溶酶体降解和再生的主要细胞内机制。尽管这些都是发育调节途径，但当受到胁迫时也能被激活，比如饥饿、热处理和低温等。减数分裂期间的自我吞噬作用造成了整个细胞生理学状态的不稳定，这可能将赋予小孢子在预处理期间伴随外界刺激转换到孢子体发育途径的能力［10］。如何依据两组小孢子——活力小孢子与非活力小孢子、胚性小孢子和非胚性小孢子——在形态学、细胞学、生理学及发育学等方面的特征差异，发现和发明出能够高效快捷地将之彼此筛选分离的指标和方法，以提高活力和胚性小孢子在外植体小孢子中所占的比率，进一步增大胚胎诱导率，还有待于更多的研究去探索。

花粉培养即通过人工培养使花粉经孢子体途径获得单倍体再生器官或植株，用于基础科学研究和育种实践。孢子体发育分为两个阶段［7］。

第一阶段，小孢子经过几次有丝分裂后形成多核花粉（或多细胞花粉）。根据启动雄核发育时的细胞分裂方式不同，该阶段又有4种主要的发育途径［3］:①A-V途径。单核小孢子进行不均等分裂，得到大小不等的两个细胞，之后大细胞持续分裂，最终发育为单倍体植株，即营养细胞；而小细胞停止分裂或分裂一两次后退化，即生殖细胞。这种发育方式在高等植物中较为常见，如大麦、小麦和黑小麦等的雄核发育均依此进行。②A-G途径。单核小孢子不均等分裂，所得的生殖细胞保持不断分裂，最终发育成为单倍体植株，而营养细胞停止分裂或仅分裂到有限程度即退化。此方式较为少见。以上二者统称“不等分裂途径”。③B途径。亦称“均等分裂途径”。此途径中小孢子进行均等分裂，得到的营养细胞和生殖细胞大小相同，且二者继续同时分裂共同形成单倍体植株。甘蓝型油菜的雄核发育便依此方式发生。④C途径。小孢子营养核与生殖核不独立分裂，而在同一纺锤体上同时分裂与融合，产生二倍体或非单倍体胚。此外，还有一些小孢子通过重复游离核分裂而进行发育，但游离核的前途如何尚不清楚。

第二阶段，多核花粉继续分裂分化发育成为单倍体植株。根据发育方式不同，此阶段又有两种可能的发育途径——胚状体途径（如曼陀罗）和器官发生途径（先形成愈伤组织，再分化产生根、芽和完整植株，如水稻）。研究发现［12］，正确有效的人为调控可使两途径相互转变，特别是外源激素的调控，作用明显。同时二者各有特点:器官发生途径易发生染色体变异，但其中自行发生的染色体增倍过程能够使得二倍纯合子植株大量形成，从而省去了人工使用秋水仙素诱导加倍的过程，而且二倍体幼苗生活能力强，更容易成活；胚状体途径细胞较稳定，变异较少。因此，人们多希望诱导获得胚状体。至于禾谷类植物，常倾向于以器官发生的途径再生植株。

孢子体途径为何会存在？对此，鲜有讨论。Horner与Mott于1980年报道，烟草单倍体植株是由非典型小孢子产生，此类小孢子易重复分裂——即仅某些特殊小孢子亚群才有可能诱发孤雄生殖，而正常小孢子可能不行。Heberle-Bors在1985年报道，用能引起植株雄性不育的杀雄剂和杀配子剂（乙烯利、生长素和抗赤霉素化合物）处理供体植株会增加胚性花粉量。离体培养的胚性花粉有可能就是在生长过程中因各种自然或人为因素而发生雄性不育的花粉。当然，这个观点有待于直接的试验验证。同时，花培时对供体植株及外植体进行一定逆境处理（如低温、高温、高渗透压等），可提高花粉植株诱导率，即可促进孢子体途径表达。花粉孢子体发育很有可能是极少部分特异小孢子在一定外界环境的刺激下而发生的一种适应性表达，即当受到一定环境条件的影响时小孢子不能通过正常的配子体途径延续后代，传递遗传物质，此时便改变内部生理、结构和遗传机制，选择通过孢子体途径努力延续自身遗传基因。这种适应性表达在离体和非离体条件下均能发生，其表现被发现与否取决于是否遇上适宜继续生长发育的条件。非离体条件下特异小孢子可能受到体细胞或其他正常小孢子的干扰难以进一步生长发育而退化。

另外，王宪曾［13］和加藤幸雄等［14］报道，花粉细胞中内含物丰富，主要包括植物激素、糖类和脂类、维他命类及氨基酸等等。花粉中的游离氨基酸含量与花粉的育性、分类及生长紧密联系。花粉的化学组成和贮藏物的种类及数量同时受到基因型和环境因素的影响，即其存在基因型差异。对于碳水化合物和脂类，甚至存在植株间差异。这可能与局部环境差异有关，如玉米花粉中淀粉含量在品种之间存在着12%～30%的差异；在弱光下，成熟花粉的碳水化合物含量变少［14］。据王兆龙1998年报道，同一玉米雄穗花序上，小穗中第1颖花较第2颖花发育及物质累积要早且快，开花时花药鲜、干重均略高。王志武等［6］在大麦中也发现，同一时期内同一穗中可能拥有3～4种处于不同发育阶段的花粉，其中中间小穗的花粉发育较两边的要早。还有研究报道，不同花粉细胞中渗透压大小也不同［15］，这可能与化学成分及其数量不同有关。花粉粒的充实程度也可能与花粉植物胚状体的诱导有直接关系。饥饿作用中小孢子内的糖类代谢似乎可以佐证。看来，因少淀粉或无淀粉而引起的花粉败育（包括典败、圆败和染败）可能是一种天然的饥饿作用，会造成不育花粉分解自身内部营养物质和组成结构以存活。伴随着花粉中的营养成分和结构物质分解，一些处在双核中期的花粉细胞进入孢子体发育途径［16］。只是没有外部营养供应时，发生了发育途径转变的小孢子便会死亡。因此，不育花粉是否更易诱导单雄生殖，值得进一步研究证明。

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综上所述可见，对于相同品种的不同个体，同一个体（花序）上的不同小穗，乃至同一小穗中的不同花药，可能由于局部生长环境、植株花期和物质分配的不同造成其化学组成、营养条件及细胞渗透势等的不同，从而进一步导致其花粉群体内个体生理状态、细胞周期及发育状况的差异。特定品种花粉进入孢子体发育途径的自身条件与外界条件要求在理论上应是一定的。因此，这便造成同一批花粉内部不同个体间诱导结果的差异。在进行实验取材时，除了选择合适发育时期的花粉，还要特别注意花粉来源部位的适宜性和统一性，最好将供体材料培养于可控的人工气候室中，以便调控并尽量统一供体植株的生长环境，以产生一定规模的同质花粉群体供培养。

以此观之，外植体预处理或预培养能够在一定程度上提高花粉培养的诱导率的现象似乎也预示着同一品种花粉异质性的可同化性，即通过一定的调控处理，使得处于不同发育时期不同营养状态和内源激素水平的花粉细胞达到相同或相近的状态。Hu和Kasha 1999年研究发现，小孢子在预处理期间经历的胁迫处理造成了一种细胞分裂周期的整体协调。孟金陵［4］也认为，高温可以使小孢子发育同步化，增加处于发育周期中诱导敏感阶段的小孢子数。这颇类似于作物生产中种子引发时生理状态（如损伤程度、发芽活力等）不同的种子粒之间的同步化过程，而其目的是为了达到齐苗壮苗的效果。因此，花粉细胞异质性的同化调控处理方法成为提高花粉培养诱导率的一个可能的重要突破口。

2　花粉培养关键环节及生理机制

花粉离体培养是人工诱导小孢子发育途径发生转变，由配子体途径转向孢子体途径，并为发育转变后的小孢子提供一定的继续生长发育的条件，使之通过器官再生或胚状体途径形成完整的单倍体或加倍单倍体植株的过程。其中，发育途径的转变即花粉细胞脱分化过程和继续生长发育条件是花粉培养成功的关键。对于小孢子的脱分化，有人认为其只需离体条件即可发生，也有人认为其需要一定的特殊条件诱导，如各种预处理和外源激素作用。脱分化后的小孢子一部分会停止增殖或生长分裂到一定程度后停止生长而死亡，只有少部分通过四种可能的发育途径（A-V、A-G、B或C途径）继续分裂增殖，形成多核花粉，随后再进一步生长发育成胚状体或愈伤组织；生成的愈伤组织中有一部分能够继续生长分化为完整的植株，这一部分称为胚性愈伤组织，另外一部分生长会发生停滞，无法获得植株，则被称为非胚性愈伤组织。不过，在一定的条件下两种愈伤组织之间可以相互转换。因此，胚性愈伤组织的诱导与调控是花粉培养的另一个关键，重点在于提供合适的激素、碳源、氮源以及培养环境等继续生长发育条件。

从分子水平上看，花粉脱分化的实质就是一定内外条件下细胞分裂周期调控基因的选择性表达，是受到细胞内外信号刺激的成熟细胞在细胞分裂周期调控基因的指导下由细胞分裂停止状态重新进入分裂周期的现象。细胞分裂周期分为G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。G1期为特别重要的周期调节阶段，因为在这一阶段中，大部分细胞面临要么持续分裂，要么退出细胞周期的局面。在生长条件差或存在来自其他细胞的抑制信号的情况下，细胞有可能在G1期暂停更长的时间，甚至可能进入到长期的非分裂状态（G0期）。由G0期重新回到G1期是花粉细胞脱分化的重要标志。

负责细胞周期事件的大量蛋白装置于细胞周期调控系统的严密控制下，此系统的核心成分是一群被称为周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent Kinnses，CdK）的酶家族。CdKs催化来自 ATP的磷酸基团共价结合到蛋白底物上，即发生磷酸化，使得底物的酶活性或与其他蛋白的相互作用发生改变。CdK活性随细胞周期进程上升或下降，使细胞周期装置组分的磷酸化水平发生周期性变化，从而启动细胞周期事件［17］。

关于雄配子体的正常形成途径，Borg等［18］对雄性生殖细胞系特化及其保持的作用模式进行了设想:PMI（减数第一次分裂）阶段的不对称分裂形成了两个在形态和发育命运上完全不同的子代细胞（生殖细胞与营养细胞）。细胞质分裂保证了子代细胞中不同细胞命运决定子的分配。PMI阶段后，在生殖细胞和营养细胞中出现细胞分裂周期抑制因子KRP6和KRP7。FBL17在生殖细胞中的短暂表达使这些细胞分裂周期抑制因子（KRP6／7）降解，从而激活CDKA，生殖细胞进入S期。一旦完成S期，激活的G2／M期调节因子即与CDKA活性偶联（G2／M期调节因子激活依赖于DUO1），从而促进生殖细胞通过G2／M期的控制点进行有丝分裂，在有关因子的作用下发育成精细胞。营养细胞不表达FBL17，因此其CDKA活性被持续高表达水平的KRP6／7所抑制而无法进入细胞分裂周期［19］。据此可以推测，大麦、小麦等禾谷类作物孢子体发育途径中的A-V途径可能与FBL17或其类似基因在营养细胞中的表达和在生殖细胞中的受抑制有关。

禾谷类花粉小孢子细胞重新进入细胞分裂周期实现脱分化后，细胞不断有丝分裂，通常形成愈伤组织，一定诱导条件下也能形成胚状体。培养诱导形成的愈伤组织多种多样，对于其分类也有较多不同的意见，通常将其分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织两种:非胚性愈伤组织呈白色，质地松软，粘稠或水渍状，无继代和分化能力；胚性愈伤组织呈鲜黄色、质地致密、松脆、呈易分散小颗粒状、表面干燥、继代和分化能力强［20］。不同植物的愈伤组织，其质量标准有着很大的不同。对于禾谷类植物而言，色泽鲜黄或乳白、质地致密、表面光滑且凹凸不平的愈伤组织（易以器官发生的方式实现植株再生）和结构松脆、颗粒状的愈伤组织（易以体胚发生的方式实现植株再生），都属于质量好的愈伤组织［12］。王海波［12］认为，愈伤组织培养其实是一种细胞类型多样性的衍生体系，愈伤组织的类型由组成愈伤组织的主要细胞领导类型决定，并且在一定的条件诱导调控下，不同细胞类型之间的细胞可以相互转变，即胚性与非胚性愈伤组织之间可以通过调控相互转化；其调控因子按应该优先考虑的顺序依次为:培养基激素、N源（类型及用量）、无机离子（如K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO24-和PO34-等）、维生素、C源和渗透压。一般情况下，只要把握好激素和N源的使用就可达到很好的调控效果；其中生长素和还原态N主要是使细胞进入或保持在亢进状态，它们能够促进生物合成和细胞分裂、促使细胞壁松弛和膜透性发生改变等，从而愈伤组织不断生长而不利于进一步分化出根、芽等器官；细胞分裂素和硝态氮主要是使细胞进入或稳定在保守状态，多表现为促进细胞产生或强化某些功能、促使细胞间产生分工、促进某些生命活动所需物质的合成和产生代谢物等，促进愈伤组织分化。另外，物理因素也可作为调控因子，如光照、低温可作为保守因子，热激等可列为衰败因子（造成愈伤组织衰败死亡）。离体培养的核心就是“细胞状态调控”。“细胞状态”是由遗传、生理、化学、物理、组成、结构等因素控制或影响的细胞形态、结构、功能、潜能的综合反映［12］。细胞状态决定愈伤组织的质量，决定培养的效果和结果。成功的细胞和组织培养是以获得理想的愈伤组织状态为目标，协调细胞内外的各种因素，使之达到理想的组合与配合。

3　问题与展望

随着近年来国内外生物技术的不断发展，禾谷类作物花粉培养的研究不论是在基础理论还是在实践应用上都取得了较大的进步，但是仍然还有较多问题需要探讨。

（1）植物中孢子体发育途径存在的生物学意义是什么？孢子体途径是否是植物在特殊情况下的一种遗传物质传递和种群延续的特殊机制？对于这个问题的探讨有利于从进化学上更进一步地了解认识花粉培养过程。

（2）胁迫处理对于胚性小孢子来说是起到筛选纯化作用还是诱导创造作用？当前的研究只是说明其能够增加小孢子胚胎的诱导效率，而其对胚性小孢子的具体作用仍不是很清楚。有可能是通过杀死非胚性小孢子而相对增加胚性小孢子在总外植体中的比例，也有可能是使得非胚性小孢子发育转变为胚性小孢子，增加胚性小孢子的数量。这需要更深入的研究去探明。

（3）胁迫处理后小孢子的细胞学和生理学变化的信息还比较少，还不足以支持一个关于预处理后小孢子行为的全面的观点［10］。该问题的存在一方面是由于预处理和试验品种的多样性造成的，另一方面则是因为研究工作的相对缺乏所致。

（4）脱分化和多细胞花粉结构的形成（主要是细胞壁的形成）哪个才是花粉胚诱导的关键决定因子？当前两方面的论述都比较多，或者说两者都是比较重要的。对于这个问题的探讨，有利于在实践中更具针对性地去采取措施提高花培诱导率。

（5）花粉的不育性与花粉的单雄生殖反应能力之间是否存在着一定的关系？如果真如前面推测所说——花粉的不育性也许是一种天然的饥饿作用，不育花粉细胞是一种具有较好诱导条件和较强诱导潜力细胞，那么依此将禾谷类作物普遍存在且研究较深入透彻的不育系引入花培体系，对于其培养材料来源就是一个很大的突破，既利于增大培养规模，又利于提高培养效率。

另外，小孢子重新进入细胞分裂周期的基因调控机制，小孢子重新进入细胞分裂周期与体细胞相比是否存在着一定的特异性等，还有待于进一步研究。对于小孢子离体培养的遗传调控机制研究，除了细胞分裂周期的基因调控机制之外，研究比较多的还有各种谷类花粉培养能力的遗传模式［21，22］和小孢子胚胎诱导过程中关键环节的分子机制［23～25］，如小孢子胁迫前处理、花粉脱分化、发育途径转变以及白化苗的形成分子机制等；其中涉及到的基因种类众多，包括形态特征、信号转导、细胞命运决定、细胞壁变化、细胞保护、防御和毒性及胁迫反应、新陈代谢、转录翻译调控、蛋白质降解、质体发育以及物质转运等相关基因。然而由于缺乏系统有效的归纳总结，这部分理论研究成果还较难用于指导花培实践。因此对这些繁杂的分子机制研究成果进行总结归纳，使基础理论进一步转化为应用技术也非常重要。

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Research Progress on the Biological Basis of Cereal Pollen Culture

DAILi，WANG Xue-Hua*
（College of Agronomy，Hunan Agriculture University，Changsha，，Hunan 410128，China）

From the angle of plant physiological metabolism，the physiological and metabolic mechanism of series of process in the cerealmicrospore culture are summarized，at the same time，the physiological or cytologymechanism of several key process is discussed in this paper，such asmicrospore dedifferentiation and callus formation，differentiation and transformation，etc.And the current problems we are facing in this field and the direction of future development is summarized and prospected.

cereal crops；microspore culture；de-differentation；callus；physiological and biochem icalmachanism

Q943.1

A

1001-5280（2015）06-0672-06

10.3969／j.issn.1001-5280.2015.06.25

2015-04-03

戴 力（1992-），男，湖南隆回人，硕士研究生，Email:1436156290＠qq.com。*通信作者:王学华，博士，教授，从事作物栽培与耕作学研究，Email:wxh6011＠163.com。