突触功能状态与血管性认知障碍研究进展

王志强综述，王庆松审校

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)是指脑血管病危险因素(如高血压、糖尿病和高血脂等)、明显(如脑梗塞和脑出血)或不明显的脑血管病(如白质疏松和慢性脑缺血)引起的从轻度认知功能障碍到痴呆的一大类综合征。VCI 的发病率呈逐年上升趋势，其发病率仅次于Alzheimer 病(Alzheimer disease，AD)，是引起老年期痴呆、导致老年生活质量下降的重要因素之一。VCI 自1993 年由Hachinski 等首次提出后，已经成为近10 余年来社会关注的焦点，也是神经科学领域研究的热点。虽然VCI 的临床研究取得了一定进展，但其发病机制及病理生理变化仍然不明确，这就迫切的需要更多的研究为VCI 的预警诊治提供理论依据。过去的研究大多关注于神经元数量的变化，却忽略了突触损伤是VCI 早期的病理改变，与其认知功能障碍关系密切，所以都不能很好的解释其发病机制。而沉默突触的发现为VCI 发病机制的研究提供了新的思路。由于VCI 的核心问题是脑血管病后出现认知障碍，如果我们能说明脑血管病发生后突触功能状态的改变处于核心位置，而突触状态的改变又能引起认知障碍，那么就能用突触功能状态的改变来解释VCI 的发病机制。也能通过对突触功能状态的调节来寻找新的干预措施来改善患者认知状况。

1 沉默突触的概念

突触是构成神经元之间联系及信息传递的基本单位，其中仅具有突触结构，在正常情况下不产生生理功能的突触称为沉默突触［1］。沉默突触的发现主要是基于1974 年Jahromi等和1977 年Wall 等先后发现形态学观察突触数量和功能突触数量明显不相吻合，这种现象说明许多突触是处于沉默状态的［1］。随后对成年小脑研究发现有95%的突触是处于沉默状态的。一个典型的锥体神经元的树突能形成约30 000个突触(90%是谷氨酸能突触，10%GABA 能突触)，这其中有多少是沉默突触，以及沉默突触和功能突触的双向转化机制目前也不明确［2］。在大脑发育阶段，大部分未成熟的突触仅包含N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)而不含有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor，AMPAR)，在静息膜电位下这部分突触的NMDAR 仍然被Mg2+阻断处于沉默状态。经过发育，AMPAR 插入到突触后膜而激活成为功能突触，所以成熟的突触共表达NMDAR 和AMPAR［3］。以往的观点认为，突触必须要有活性才能成熟和存活，而没有活性突触不能成熟，并最终被清除，但随着研究的深入，沉默突触不仅在成熟前存在，在成年个体也存在［3～5］。沉默突触有突触前沉默(突触前神经元不能释放出足够的兴奋性神经递质，如谷氨酸)和突触后沉默，由于突触前沉默突触在出生后2 w 到3 m 即消失，但是突触后沉默突触在成年及老年都持续存在［4］，所以一般意义上所说的沉默突触或静默突触指突触后沉默突触。

2 形态学证据

典型的谷氨酸能突触包含NMDAR 和AMPAR。AMPAR介导的递质传递是配体门控型，与此相对应的NMDAR 介导的递质传递不仅是配体门控而且还是电压门控型离子通道，也就是说在静息膜电位不能传导信号。在正常的兴奋性突触传递过程中，突触前囊泡释放谷氨酸，作用于突触后膜的AMPAR 和NMDAR。但由于NMDAR 还受膜电位影响，所以在静息膜电位下不发挥功能，而只有在AMPAR 存在并形成去极化电流以解除Mg2+对NMDAR 的阻滞才能进行正常的信号传递，产生突触后膜去极化，诱发快速的兴奋性突触后电位，参与兴奋性突触传递。沉默突触与功能性突触的相互转化在神经可塑性中具有重要的作用［6］。与功能性突触相比，在形态学上，突触后沉默突触只表达有NMDAR，而不表达AMPAR［3，6～8］，也就是说沉默突触与功能突触的形态学区别就在于AMPAR 在突触后膜的出现与否。通过免疫金标电镜［5，9］、免疫细胞化学［10］、激光共聚焦显微镜［3］都观察到沉默突触的存在，这种形态学观察到的沉默突触与电生理观察到的沉默突触结果相一致［3，4］。

2.1 NMDAR 及其功能 功能性的NMDAR 是由NMDAR-1 亚单位(NR1)和多个NR2 共同形成的四聚体(或五聚体)。NR1 是构成离子通道型NMDAR 基本亚单位［3，6，11］;NR2 是调节亚单位，不同NR2 组成的NMDAR 表现出不同的脑内分布与生理学特性。在不成熟突触，主要是由NR1 和NR2B 亚单位组成，随着突触的成熟NR2A 取代NR2B，但是后来研究发现，在发育过程中NR2A 与NR2B 的转化可能是双向的，不同的驱动能促进不同的转化方向，从而对成熟的突触产生不同的影响［11］。对发育过程中受体亚单位组合方式的认识，加深了我们对突触功能及突触可塑性认知。NR2B 基因敲除发现功能突触数量明显增加，说明在发育过程中NR2B 对沉默突触的保持具有重要作用，同时NR2B 对长时程增强(long-term potentiation，LTP)的诱导也有重要作用，而NR2A 亚单位并不影响功能突触的数量，但是能改变突触的强度，说明突触功能发挥调节作用可能是通过未成熟突触NDMAR 的增加能抑制AMPAR 的转录、翻译;细胞内Ca2+通过蛋白激酶(如钙-钙调素依赖性蛋白激酶、PKA、PKC)、蛋白磷酸酶1/2A/2B 等来影响LTP 和长时程抑制(long-term depression，LTD)，从而调节AMPAR 从突触后膜的转运、突触后AMPAR 亚单位的组成及已有的AMPAR 的转录后修饰等过程。在LTP 的早期是通过原有AMPAR 的转录后加工修饰来调节，后期则是通过代偿性产生新的AMPAR 来调节。进一步研究还说明树突形态改变与沉默突触/功能突触的转化可能存在一定联系［11］，但是具体机制还不明确。NMDAR 主要分布在海马、前脑皮质、前扣带区和梨状皮质等结构神经细胞的突触后膜。在兴奋性神经元，NMDAR 主要分布在树突棘的突触后膜，且主要分布在突触后致密区。

2.2 AMPAR 及其功能 AMPAR 是离子型谷氨酸受体之一，是中枢神经系统兴奋性突触后膜最重要的组份，参与突触传导和突触可塑性。AMPAR 是由GluR1-G1uR4 4 个亚单位组成的同聚体或异聚体复合物，每个复合物包括4～5个亚型。虽然GluR2/3 异聚体在大脑中发挥重要作用，但是GluR3 的含量不足GluR1 或GluR2 的10%，所以在成熟的海马和新皮质等大脑前部，尤其是锥体神经元，AMPAR 受体主要由GluR1 和GluR2 构成［12～16］。GluR4 主要分布在小脑和出生后早期海马等结构［17］。随着海马神经元的发育，成熟神经元比未成熟神经元树突表面NR2B、GluR2 及共定位的受体簇密度均显著增加;然而NR2B 与GluR2 共定位的程度却是下降的。提示兴奋性突触形成过程中NMDAR 和AMPAR 的组合方式是异质性的。并随着发育阶段而改变。通过对GluR1 和GluR2 进行研究，这两个亚基对我们学习能力有不同的影响。GluR1 对新记忆的形成至关重要，GluR2 在记忆储存上具有重要作用。研究人员还发现，细胞内GluR1数量的增加并未增加细胞内受体的数量，也未增加突触的数量。对GluR2 的研究也产生了相同的结果。因此，AMPAR功能的发挥主要取决于该受体在细胞膜上的位置。仅仅增加细胞内的AMPAR 的数量并不足以调节神经细胞之间的连接，进而影响学习记忆等能力［12］。

2.3 沉默突触形成假说 目前对沉默突触的形态学研究远远落后于功能学研究。LTP 是中枢神经系统信息处理、学习记忆功能的基础，而沉默突触的激活(即转化为功能突触)被认为是突触功能增强的重要机制之一。LTP 的刺激能够激活沉默突触，也就是说在LTP 的诱导下通过AMPAR 插入突触后膜能使沉默突触转化为功能突触［4，18］。通过对AMPAR 亚单位的电生理检测发现，在LTP 诱导下的确是有GluR1 的转移［18］。然而在LTP/LTD 的诱导下AMPAR 是通过胞内储备池转运到突触后膜还是通过邻近突触扩散的还不明确，这也就形成了沉默突触形成的各种假说。形态学沉默突触的形成有3 种假说:(1)AMPAR/NMDAR 的比例在中枢神经系统发育早期的比例相对较低，随着神经系统的发育其比例逐渐增加。在发育早期，通过电生理发现只有膜电位在静息膜电位时才能完成信息传递，由此认为突触传递主要是由NMDAR 来完成。随着神经系统的发育，电生理观察到单纯NMDAR 反应逐渐降低。由此说明NMDAR 先于AMPAR 出现在突触后膜，随着神经系统的发育，AMPAR 逐渐从突触后储备池或者通过细胞内合成而插入到突触后膜;(2)由于谷氨酸与NMDAR 的亲和力是AMPAR 的100 倍，所以也有学者认为AMPAR 和NMDAR 共同定位于突触后膜，只是在发育的早期突触前膜释放的谷氨酸浓度较低或者由邻近的突触前膜溢流的谷氨酸，以致到达突触后膜的谷氨酸浓度较低，只能激活NMDAR 而不足以激活AMPAR，因而导致AMPAR 沉默;(3)还有一种假说就是“转录后修饰假说”。该假说认为，两种受体共同出现在突触后膜，在发育早期AMPAR 功能沉默是由于连接蛋白或者是由于缺乏转录后修饰(如磷酸化等)［6，9］。解决以上假说的办法就是在神经系统发育过程和突触激活过程中对这两种受体的调节过程进行分析，在解剖形态学上对每个突触中AMPAR 和NMDAR的表达进行定位、定量测定。免疫金标电镜观察到出生后随着神经系统的发育，NMDAR 浓度无明显变化，而每个突触AMPAR 的浓度及含AMPAR 的突触数量都有所增加［5，9］。每个突触AMPAR 的浓度从P2 到P10 增加了1.7 倍，从P10到5 w 增加了2 倍;与此同时，在P2 含GluR1 的突触只有16%，到出生后5 w 增加到了50%。含GluR 2/3 的突触也从44%增加到了75%［9］。为了排除单个受体亚基识别效率低下的问题及识别海马组织所有AMPAR，Nusser 等制作了多克隆抗体识别AMPAR 所有亚基(GluR1/2/3/4)，结合海马连续切片观察进一步证实了上述假说，同时在成年大鼠海马也观察到了AMPA 沉默突触［5］。对单个神经元培养进行三重荧光标记免疫细胞化学研究证明邻近突触溢流假说不足以说明沉默突触的形成［10］。通过AMPAR 分子N 末端和C末端分别标记分析显示突触内并没有AMPAR 储备池供沉默突触的激活，然而却在树突内上发现大量AMPAR 可能发挥AMPAR 补充池的作用［6］。目前的结论还不能说明哪种假说完全正确，但是目前研究结果偏向于AMPAR 是通过转运进入突触后膜而不是在原位激活。

3 AMPAR 与脑缺血

中枢神经系统AMPAR 的分布处于动态变化之中，在神经细胞内，受体存在着两个循环:一方面，该受体不断地被锚定到突触后膜上，然后又通过胞饮作用进入到细胞内，如此往复循环，介导神经信号的传导;另一方面，单个神经细胞中各个突触之间不断进行受体交换。即受体不断地从一个突触转移到另一个突触［19］。目前认为AMPAR 在突触可塑性的调节中发挥重要的作用，包括LTP、LTD 及自身稳定的突触可塑性(homeostatic synaptic plasticity，HSP)［11］。AMPAR调节突触可塑性主要是通过AMPAR 的转运及磷酸化［20］。目前研究显示，在脑缺血后突触功能的紊乱早于神经元的死亡。在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)动物模型中也发现学习记忆能力和神经功能的缺陷明显早于神经纤维缠结形成和神经元的丢失，而且证明β 淀粉样蛋白形成能促进谷氨酸受体(AMPAR)的内吞，从而降低突触后AMPAR 的数量导致沉默突触的形成［21，22］。因此，神经元的死亡不足以解释脑缺血后认知等神经功能的异常。而突触功能的改变可能对缺血后神经系统功能的改变发挥更重要的作用。

GluR2 是AMPAR 控制Ca2+通透的关键亚基。钙离子能自由通过GluR1、GluR3、GluR4 组成的复合体，当GluR2 出现在复合体中，对钙离子的通透性下降［23］。所以GluR2 对AMPAR 介导的信号传递至关重要［24］。在缺血再灌注损伤后30 min 后，突触后膜GluR2/3 一过性升高而突触周围和突触内GluR2/3 都降低，很快突触后膜GluR2/3 降低到对照组水平之下而细胞内GluR2/3 含量却恢复到正常水平。说明在缺血再灌注损伤后，突触周围及突触内GluR2/3 一过性聚集到突触后膜，然后又通过胞吞作用转运到突触后储备池。经过对受体转运机制研究发现，在GluR2/3 转运过程中，受体磷酸化作用明显增强、Src 激酶明显激活，而且转运相关的GluR2/3-S880 明显增强，说明磷酸化作用在缺血再灌注损伤后AMPAR 的转运中发挥重要作用［25］，缺血后给予丙泊酚能抑制GluR2 的内吞从而增加突触后膜GluR2 的表达［26］。沙鼠缺血再灌注损伤后72 h，GluR2 在海马CA1锥体神经元内部、基底部及邻近的树突的免疫表达明显降低，而相邻切片中相同部位的Glu1 含量没有明显变化。在CA3、DG 区GluR1、GluR2 的含量未见明显变化。结合神经元死亡(CA1区神经元的死亡见于7 d 后)研究资料显示，CA1椎体细胞GluR2 亚单位的表达下降早于神经元的死亡;GluR2 在CA1区的降低是由于每个锥体神经元中GluR2 含量的降低而不是由于神经元的死亡;GluR1 在缺陷损伤后的含量是稳定的［23］。在4-VO 致大鼠全面性缺血模型中，在缺血6 h 和12 h后CA1区GluR2 mRNA 表达下降，在24 h 和48 h 下降更明显，这种变化也早于神经元的死亡［27］;而且在成年大鼠脑缺血后GluR2 表达的下调引起的Ca2+内流增加不足以引起神经元的死亡，通过GluR2 基因敲除后，海马CA1、DG 亚区神经元的死亡并未见明显的增加，所以神经元的死亡可能存在其他更加重要的内在机制［28］。进一步说明突触功能变化可能是缺血后神经系统病变的关键与始发因素，或者至少突触功能改变发挥作用处于神经元死亡的上游。

海马神经元体外培养说明缺氧能导致突触后膜表面及突触GluR1 表达增加，而GluR1 向突触后膜内吞作用明显减弱，其中神经穿透素-1(neuronal pentraxin 1，NP1)发挥重要作用［29］。出生后10 d 的大鼠暴露于低氧环境后48～72 h 后沉默突触明显降低(降低43%，NR1 和synaptophysin 共定位)，而功能突触增加(53%，NR1 和Glu1 共定位)，并且Glu1 的增加是由于AMPAR 向膜转运引起的，同时LTP 能力也明显降低，并且这种状态一直持续到成年［3］。通过基因敲除动物GluA1 磷酸化位点的研究发现GluA1 是LTP 及LTD 表达的关键亚单位，同时GluA1 对记忆的保持发挥重要作用［14］。在成年大脑缺血再灌注损伤后30 d 后NR2B、Glu4 无明显变化［30］。

目前对脑缺血后AMPAR 的研究主要集中在GluR2，主要是由于其对Ca2+通透而引发神经元死亡。但是单纯的神经元死亡能够解释肢体感觉、运动障碍，但是并不能解释脑缺血后认知障碍及相关的神经心理学变化，脑血管病后认知情感障碍严重影响患者及患者家庭生活质量，给家庭、社会带来了巨大的经济负担。所以需要迫切需要新的观点来探索其发病机制，而对突触功能状态的研究可能会对患者带来新的希望，所以未来可能需要从突触功能方面寻找突破口。

4 AMPAR 与学习记忆

尽管老年及其他神经退行性疾病伴随着神经元数量的减少，但是单纯的神经元数量减少不足以解释老年、脑血管病相关的认知障碍。目前大部分学者认为突触的结构、功能变化(树突分支减少、树突棘密度降低等)可能是引起老年认知障碍的分子基础。也就是说认知功能下降是由于突触可塑性机制的损害而不是缺乏突触传递［4］。LTP 能增加GluR1向突触后膜的转运，促饥饿素受体生长激素1a(ghrelin receptor growth hormone secretagogue type 1a，GHS-R1a)参与这种机制［31］。GluR1 基因敲除小鼠在T 迷宫及水迷宫中表现出正常的空间参考记忆，而在T 迷宫测试中空间工作记忆能力明显下降，电生理结果显示CA3-CA1突触的LTP 消失，这说明GluR1 缺乏会引起短期习惯化障碍，或者说海马GluR1 在编码空间记忆形成中发挥重要作用，GluR1 有利于记忆的形成［16，32，33］。由于AMPAR 在记忆形成过程中发挥重要作用，所以为了证明AMPAR 在记忆形成过程中的动态变化，经过T 迷宫训练，含GluR2 的复合体和含GluR3 的复合体水平明显降低，而含GluR1 的复合体和含GluR4 的复合体水平明显增加［16，34］。GluR4 基因敲除小鼠在T 迷宫中较正常小鼠空间记忆能力轻度提高，而在Barnes 迷宫中空间参考记忆的保持未见损伤但是空间记忆的获得却明显受损［17］。进一步研究发现，GluR4 与小鼠在T 迷宫中潜伏期正相关而与动物运动速度负相关［34］。这中异质性说明记忆形成不能单纯以AMPAR 亚单位的变化来解释，而是在多种亚单位复合物综合作用下形成的结果。GluR2 和GluR3 都敲除的小鼠突触基本传递明显受损，而这种基因缺陷小鼠CA1突触长期变化，包括LTP、LTD 等完全不受影响，说明GluR1 单独完全能够完成LTD 等突触可塑性变化［35］，而在GluR2 基因敲除后LTP 得到增强而LTD 消失［16］，这种差异或许是由于GluR3或者GluR1 和GluR3 相互作用的结构，当然需要在以后的实验中进一步验证。

总之，目前AMPAR 参与学习记忆已经基本达成共识，但是由于其机制复杂，不同的亚单位组合形式会对学习记忆产生不同的影响，但是就目前资料分析，GluR2 在学习记忆及AMPAR 参与的突触可塑性调节过程中仍然发挥突出的作用。

5 总结与展望

虽然突触后AMPAR 沉默突触在神经系统发育、突触可塑性、神经系统退行性疾病及认知功能障碍中发挥重要作用，但是目前对突触后AMPA 沉默突触的研究主要局限在神经系统发育模型中，主要是通过膜片钳等电生理技术，其次是形态学观察来证明沉默突触的存在及其在突触可塑性过程中发挥的重要作用。通过这些技术手段说明在神经系统发育过程中伴随着AMPA 沉默突触的激活。但是在成年动物模型及病理状况下的研究很少，主要是由于AMPA 沉默突触在成年神经系统中含量较少，用神经电生理技术很难监测微小的变化，比如在神经系统疾病发病过程中AMPA 沉默突触与功能突触的相互转化等用电生理技术很难达到，但是形态学技术，尤其是免疫金标电镜、放射自显影技术及激光共聚焦显微镜的应用能够从形态学上定位、定量的观察沉默突触的变化，而且在病理状态下是否存在功能突触与沉默突触的转化，如果存在，那么沉默突触的数量必将存在大量增加。遗憾的是，据我们所知，还没有研究沉默突触与血管性认知障碍相关性的报道，但是我们可以间接的从脑血管病及认知障碍中沉默突触的变化研究来初步构想血管性认知障碍中沉默突触所发挥的作用。结合突触损伤在VCI 发病早期即存在，我们有理由相信，沉默突触的转化参与了VCI 的发病，所以我们提出突触功能状态在VCI 发病中发挥的作用意义深远，值得国内外学者进一步探讨。然而对其具体损伤机制、是否存在沉默突触与功能突触的双向转化、如果存在这种转化，那么这种转化是否构成VCI 发病的核心问题等方面了解的还比较少。我们期待着更多的研究来证明VCI 与沉默突触的关系，对这一系列问题的阐述必将进一步揭示VCI的发病机制，从而为VCI 的早期预警及寻找新的防治突破口提供必要的理论依据。

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