H2S 在缺血性脑血管病的研究进展

余 亮，蔡 川综述，褚晓凡审校

一个多世纪以来，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)一直被认为是一种有臭鸡蛋气味的毒性气体。随着研究深入，如今其作为继一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)后另一种具有重要生理和病理生理功能的新型气体信号分子被医学界所关注。近年来国内外学者对H2S 的研究主要集中在心血管［1～4］、消化［5，6］及泌尿［7～9］等系统，发现其能显著减轻上述系统器官的缺血性损伤，而针对H2S 对缺血性脑血管病的防治研究也逐步深入。缺血性脑血管病是导致人类死亡的三大主要疾病之一，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点。缺血性脑血管病的二级预防是目前临床干预的主要策略，而在开发挽救急性期濒死的脑组织细胞、增强其缺血耐受及减小脑损伤体积等方面的新药目前尚未取得明显突破。

1 脑内H2S 的合成与代谢

1989 年Warenycia 等［10］已在大鼠和人脑组织中检测到内源性H2S 的存在，提示H2S 可能具有较重要的生理作用。1996 年Abe 和Kimura［11］报道了在大鼠海马和小脑组织中胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)高表达和大鼠脑组织匀浆能产生H2S，通过实验证明内源性H2S 极可能是一种神经活性物质。哺乳动物脑内的H2S 的生成跟其他器官一样，主要通过含硫氨基酸的代谢产生。CBS 和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)是两个能分解L-半胱氨酸产生H2S 的酶，它们属于磷酸吡多醛-5’-磷酸依赖性酶，通过它们的酶解催化是体内产生H2S 的主要途径。另外，L-半胱氨酸还可在天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AAT)作用下生成3-巯基丙酮酸，然后被3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST)脱硫产生H2S。也有研究发现D-半胱氨酸能通过3MST 和D 型氨基酸氧化酶(D -amino acid oxidase，DAO)途径产生H2S［12］。此外还有少量H2S 可通过非酶促反应产生，在葡萄糖氧化过程中，糖酵解和还原型辅酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide，NADPH)能使硫元素还原为H2S［13］。细胞内合成的H2S 至少以两种方式释放:一是合成后立即释放出来;二是合成后的H2S 以酸不稳定性硫和结合硫烷硫原子两种形式先储备起来，在生理信号的刺激下释放出来。

内源性H2S 是体内含硫氨基酸的代谢终产物，其以气态形式和硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)存在。NaHS 在体内能解离成Na+和HS-，后者能与体液中H+中结合生成H2S。H2S 与NaHS 在体内维持着一个动态平衡。NaHS 溶液中H2S 的浓度相对恒定，因此，NaHS 溶液常作为H2S 的供体［14］。

虽然CBS 和CSE 同为催化H2S 生成的关键酶，但在不同的组织中两种酶的分布不同，Abe 和Kimura［11］研究发现CBS 是大脑中H2S 生成过程的最主要的一个酶，且脑中CBS的活性约是CSE 的30 倍［15］，星形胶质细胞是大脑内生成H2S 的主要工厂［16］。Eto 等［17］亦报道脑组织中的H2S 生成能被CBS 阻滞剂中止，但是阻滞CSE 却没这个效果，同时在CBS 基因敲除的小鼠的脑组织中H2S 生成也是明显减少的。然而最近Shibuya 等［18］又研究发现脑组织中约90%的H2S生成是由3MST 催化。

2 脑内H2S 的生理作用

脑中H2S 潜在的生理功能包括:强化长时程增强作用(Long-term Potentiation，LTP)、维持Ca2+平衡、抑制氧化应激和调节神经传导等。在原代培养的神经元和胶质细胞中，生理浓度的H2S 通过激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)促进环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的生成，cAMP 激活其依赖的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，激活的PKA 可通过磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA 受体)的NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B 亚基的特异位点来增强NMDA 受体介导的兴奋性突触后电位，诱导增强LTP［19］。除此之外，H2S 也可以通过cAMP 途径以剂量依赖方式降低NMDA 受体反应时间(如增强NMDA 受体和配体亲和力)。Han 等［20］研究发现H2S 能上调位于突触前后膜上的一种G 蛋白耦联受体—γ-氨基丁酸B 受体(GABABR)的表达;突触前膜的GABABR 能通过抑制电压依赖型Ca2+通道来调控部分神经递质如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)等的释放。所以，这些都表明H2S 在维持大脑的兴奋和抑制方面具有重要作用。

在细胞内外的微环境中，H2S 表现出保护神经元对抗氧化应激的能力。还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是大家熟知的脑内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。在体外试验中，H2S 表现出同还原型GSH 类似的神经保护能力。Whiteman 等证实H2S 能抑制次氯酸介导的神经细胞氧化损伤［21］和过氧亚硝酸盐导致的蛋白硝化及细胞毒性［22］。H2S 亦可有效地清除机体内过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)，可广泛地抑制体内活性氧［23］。虽然神经元(和神经胶质细胞)中GSH 浓度约是5 mM，但是其细胞外浓度几乎是零［21］。因此，细胞外环境中调控非GSH 抗氧化剂(如抗坏血酸)的生成来清除氧自由基就显得相当重要了［24］。H2S 与GSH 相比其在细胞内高浓度、易弥散和强抗氧化的特性让其作为另外一种重要的内源性抗氧化剂受到重视。Kimura 等［25］发现H2S 能够通过提高γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的活性从而增加神经元中还原型GSH 的生成;NaHS 能通过增强γ-GCS 活性和上调L-半胱氨酸(L(+)-cysteine，Cys;Cys 是能影响脑GSH 合成速率的重要前体)的转运速度，从而增加GSH 的生成。增加的GSH 能够保护神经元免受由高浓度Glu 诱导的氧化应激损伤导致的细胞程序化死亡［25］。细胞内产生的H2S 释放到细胞外后还原胱氨酸(Cystine)成Cys，而Cys 很容易通过半胱氨酸转运蛋白被运送到细胞内，在细胞内转化成GSH［26，27］。由母体供血的缺血再灌注胎鼠模型因氧化应激导致GSH 水平下降，H2S 通过恢复降低的GSH水平保护胎鼠大脑［26］。除去抑制神经元线粒体中的氧化应激、提高神经元内GSH 水平两个途径，H2S 也能通过稳定神经元膜电位来发挥神经保护作用［28］。

H2S 不仅能调节神经元的功能，也能调控星形胶质细胞的功能。星形胶质细胞的功能之一是将营养物质从毛细血管运送到神经细胞内;另一个功能是通过部分地移去神经元兴奋时释放的神经递质和离子来维持神经元周围引发神经冲动所必需的阳离子环境。神经元间通过产生动作电位相互交流，星形胶质细胞及其他胶质细胞间的信息交流方式则是依赖于Ca2+信号介导［29］。NMDA 导致神经元兴奋，随之在星形胶质细胞间才能诱导出“钙波”;当没有神经元存在时，NMDA 并不能诱导出星形胶质细胞间的“钙波”［30］。表明星形胶质细胞能够对神经元分泌的神经递质直接做出反应，兴奋的神经元是诱导星形胶质细胞间“钙波”出现的必要条件。Smith 等［31］用钙离子成像技术显示，当给培养的星形胶质细胞加入神经递质谷氨酸时，其反应就如同是通过神经元释放神经递质对其影响一样，它们之间通过相互信息交流模拟神经元放电。当星形胶质细胞内［Ca2+］i 增加到足够大的程度时可在相邻星形胶质细胞间诱发钙波传播［32］，而星形胶质细胞间正是只能通过细胞外介质而不是物理接触来传递信号［33］。外源性H2S 能在原代培养的星形胶质细胞和海马脑片中诱导出在临近星形胶质细胞间传播的“钙波”［30］，其能够通过细胞膜上Ca2+通道跨膜转运和释放细胞内Ca2+储备来增加细胞内自由Ca2+浓度(［Ca2+］i)。

3 H2S 对缺血性脑血管病的影响

在中枢神经系统中，H2S 能增强海马长时程记忆，调控大脑细胞内Ca2+浓度和pH 水平。在缺血性卒中［34，35］、阿尔兹海默病［36］、帕金森病［37］和复发性热性惊厥［38］中均有H2S的生成和代谢障碍。在一些病理状态下，H2S 合成酶［量和(或)活性］发生改变，从而导致H2S 水平发生改变，这一因素可能参与相关的病理改变。

在缺血/缺氧等病理条件下，体内增加的H2S 可能通过激活神经细胞上Na+通道和NMDARs 引起大量Na+内流而破坏其离子稳态环境，从而损伤神经功能［39］。而Tay 等［40］的研究结果却与之相反，他们发现H2S 能通过调节腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)敏感的K+通道(KATP)/蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)/胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)/热休克蛋白90(heat shock proteins 90，Hsp90)通路在脑组织缺氧导致的神经元死亡过程中保护神经元抵抗缺氧损伤。Florian 等［41］利用大鼠局灶性脑缺血模型研究发现通过H2S 诱导的低体温状态(30.8 ±0.7 ℃)可以明显缩小梗死面积。Qu 等［42］利用大鼠大脑中动脉永久闭塞模型(MCAO)，通过调控大鼠体内H2S 水平发现增加体内H2S 浓度可以扩大脑组织梗死体积。Ren 等［43］研究发现大鼠全脑缺血再灌注后12h 时内源性H2S 水平明显提高。同样，Shao 等［44］也报道过大鼠全脑缺血再灌注后6h 时H2S水平明显提高，同时此变化可被CBS 抑制剂中止。以上改变可能是脑缺血性损伤产生了过多的超氧化物和谷氨酸盐，从而在再灌注早期诱导H2S 水平增高。地佐环平(MK-801)可以非竞争性特异性拮抗NMDA 受体作用，减少谷氨酸盐的毒性，Cys 与NaHS 扩大梗死面积的效应能被MK-801 终止，表明H2S 极大可能是通过激活NMDA 受体发挥此效应［42］。Marutani 等［45］利用一种可释放H2S 的NMDAR 受体拮抗剂(S-memantine)干预全脑缺血再灌注损伤，发现其减小梗死体积、提高模型生存率及改善神经功能缺损的效果优于美金刚(Memantine)和ACS48(一种缓慢释放H2S 的供体)。如前述，生理浓度的H2S 能增强NMDA 受体功能［19］。因此，我们推测在缺血性卒中时H2S 亦能增强NMDA 受体介导的谷氨酸盐的兴奋性毒性。在大鼠MCAO 模型中，观察到皮质梗死灶中H2S 浓度升高和H2S 的合成增强，进一步证明了H2S 在缺血性卒中组织损伤中有重要作用，其病理生理学机制可能是增强了NMDA 受体介导的Ca2+超载［42］。另一种可能的说法是H2S 通过改变脑血流量来影响脑梗死的病理变化，因为H2S 可引起血管舒张，而血管扩张药一般都具有一定的神经保护作用，能减小梗死面积［46］。

H2S 对神经元的保护作用主要通过抗炎、抗氧化和抗凋亡等方面来体现。Yin 等［47］研究发现大鼠全脑缺血再灌注损伤，内源性H2S 可通过抗氧化应激、抗炎和抗凋亡发挥脑保护作用。炎症反应在局灶性脑缺血神经元死亡中扮演关键性角色，但是在短暂的全脑缺血后再灌注情况下也会出现炎症反应［48］。Koerner 等［49］报道海马与大脑皮质中炎性基因mRNA 表达水平在全脑缺血后24 h 明显增高。星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症反应产生的炎性因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)、白细胞介素6(interleukin，IL-6))能抑制脑内CBS 的活性和H2S 的生成，但对细胞进行H2S 供体NaHS 的预处理能部分扭转这一作用，表明H2S 具有抗炎作用［16］。因此，可以推测缺血再灌注后的炎症应答可抑制H2S 的生成，亦可部分解释全脑缺血再灌注后24 h 时H2S 水平下降［43］。H2S 能够抑制神经炎性反应的具体机制还不太清楚。有研究表明，H2S 能通过抑制一氧化氮合酶的诱导合成和P38 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)引起的小胶质细胞和星形胶质细胞的炎性反应中发挥抗炎作用［50］。而Zhou 等［51］发现H2S 能激活依赖于钙调蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)的AMP 依赖的蛋白激酶(AMPK)，使小胶质细胞转变为M2 抗炎表型，在小胶质细胞介导的神经炎性反应中发挥抑制作用。同时，H2S 也能保护神经元免受谷氨酸等诱导的氧化应激损伤［25，26］。其抗氧化应激的机制如前述。但是Li 等［52］报道在大鼠局灶性缺血性脑损伤模型中，体内H2S 通过调控氧化应激诱导的细胞凋亡来发挥其双重效应:低浓度NaHS (2.8 mg/kg)组表现出通过抑制神经细胞凋亡而缩小损伤体积，高浓度NaHS (11.2 mg/kg)组则可加重损伤。在抗凋亡方面，H2S 在鱼藤酮诱导的神经元凋亡的病理过程中发挥抗凋亡的作用，包括调节Bcl-2(一种抗凋亡的蛋白)和Bax(一种促凋亡的蛋白)的水平抑制细胞色素C 的释放，开放线粒体ATP 敏感的K+通道(mitoKATP)，抑制p38/JNK MAPK 通路的激活等［53］。Luo 等［54］通过建立体外模拟脑缺血-再灌注(I/R)诱导细胞凋亡的糖氧剥夺再灌注(OGD/R)模型，发现H2S 能抑制OGD/R 诱导产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)的激活和线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)的下降，起到抗凋亡的作用。

生理水平的H2S 表现出神经保护作用［40］，然而高浓度的H2S 可能通过激活NMDA 受体表现出神经毒性［45，55］。可能高浓度NaHS 过度提高了体内H2S 水平而超过了生理范围，使神经元在缺血再灌注时更易损伤;相反部分学者利用低浓度的NaHS 使大脑缺血再灌注实验动物模型体内H2S水平恰好维持在生理范围之内，从而起到保护神经元的效果。这个推断恰恰也可以解释一些不同实验模型得出的相悖的结论。

有研究表明H2S 的神经保护效应具有浓度依赖性［56］。目前研究发现H2S 在胎鼠大脑缺血再灌注损伤中抗氧化应激有两个机制［26］:一是通过增加胱氨酸/半胱氨酸转运蛋白而增加谷胱甘肽(GSH)的生成和促进GSH 在线粒体内再分布;二是线粒体中产生的H2S 能直接表现出抗氧化能力。此外，Minamishima 等［57］发现H2S 能减小小鼠心脏骤停/心肺复苏术模型大脑神经元的死亡率。外源性H2S 能提高缺血条件下海马神经元突触可塑性，抑制锥体神经元周围水肿形成和由缺血引起的核固缩，促进脑缺血后海马CA1 区生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43，GAP-43)的表达，对海马神经元具有保护作用［58］。因此，进一步的研究需要解决的是不同缺血性脑损伤模型得出结论的差异。

研究发现Cys 是体内合成H2S 的前体［11］，因此也有必要阐述Cys 在缺血性卒中的病理生理机制。Cys 能导致神经元死亡［59］，在缺血缺氧性脑损伤的病理过程中也有重要的调节作用［60］，表明Cys 能在CBS 的催化作用下先转化为H2S后发挥神经毒性作用［42］，其神经毒性作用能被CBS 抑制剂减弱［61］。高同型半胱氨酸(hyperhomocysteine，HHcy)已经是急性脑卒中的一个明显的危险因素［62，63］。有研究表明催化同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)变为Cys 的两个关键酶CBS 和CSE 恰好也是催化Cys 成为H2S 的关键酶［64］。血浆中高Cys 与急性卒中的不良后果密切相关，同时动物实验中运用CBS 抑制剂能减轻Cys 的神经毒性作用［61］。在CBS 的催化下，Hcy 可能被转化为胱硫醚，然后在CSE 作用下转化为Cys。因此暗示Hcy 和Cys 可能同时影响着卒中后的病理演变。也有报道血浆Cys 在高同型半胱氨酸卒中患者中保持不变［65］。Schurr 等［66］利用大鼠海马脑片来评估Cys 的神经毒性，发现其在正常环境下是无害的，但是在能量缺乏［葡萄糖和(或)氧气剥夺］的环境下表现出神经毒性。Slivka 等在利用蒙古沙鼠颈动脉结扎造成卒中的体外实验中，细胞外Cys 水平明显升高［67］。Cys 虽不是NMDA 受体激动剂，但其神经毒性作用能被NMDA 拮抗剂阻止［68］。由此可以推测Cys 可能通过兴奋性氨基酸或者Cys 衍生物(S-亚硝基半胱氨酸/Cys 亚磺酸盐)对NMDA 受体发挥间接的兴奋作用［69］。生理浓度的H2S 能部分通过调整MMP/TIMP(基质金属蛋白酶抑制剂)的比例对抗由HHcy 诱发的高微血管通透性［70］。

4 小结

综上所述，H2S 在缺血性脑血管病中的作用及其机制非常复杂，其作用是有利还是有害既与组织和细胞中H2S 的浓度高低有关，也与组织与细胞处于不同的病理状态和(或)在一个病理过程的不同时期有关。H2S 的生理和(或)病理作用有多种有利和有害的因子和通路参与进来，这些因素各自发挥不同的作用，再通过机体综合的表现出来。虽然H2S 作为第三个气体信号分子和对神经系统有调节作用得到了多数人的一致认同，但是其作用方式以及涉及到的分子机制依旧需要更多的研究去发掘和探索，揭示其临床应用价值，以期对缺血性脑血管病的治疗起到更大的积极作用。

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