多酚类生物学标志物与心血管疾病

修赫璐 杨睿悦 董军 陈文祥

作者单位：100730北京医院北京老年医学研究所卫生部老年医学重点实验室（修赫璐、杨睿悦、董军），临床检验中心（陈文祥）

动脉粥样硬化性心血管病（cardiovascular disease，CVD）是全球范围内危害人类健康最为严重的疾病之一。CVD的流行与膳食不合理等不健康的生活方式密切相关。调整膳食结构、推行健康生活方式是CVD预防中最为简便、经济、安全和有效的途径，已成为很多国家制定卫生经济政策的重要导向。在近年国内外几项重要的指南中，均强调增加水果蔬菜的摄入在预防和治疗CVD中的重要性［1-3］。而广泛分布于水果、蔬菜中的植物多酚类物质（polyphenols）由于具有良好的抗氧化活性，其健康促进作用越来越受到大家的关注。

1 多酚类物质的分布及种类

多酚类物质是植物化学物中最为庞大的一个群体，目前已知的种类已经超过了8 000种。多酚类物质广泛存在于我们的日常饮食中，如水果、蔬菜、豆类和谷类、可可/巧克力，以及红酒、咖啡、茶等饮料中。据估计，人们每天摄入多酚类物质的量大于1 g，大约为也具有抗氧化活性的维生素C和维生素E摄入量的10倍和100倍［2］。多酚类物质相对分子量多在100～4 000之间，是芳香环上连有一个或多个羟基的低分子量有机化合物［3］，根据其结构特点大致可以分为类黄酮、酚酸、木脂素和芪类等。其中类黄酮是种类最多、分布最广的一类多酚，由含3个C原子的氧合杂环连接两个芳香环组成，根据取代方式的不同，又分为黄酮醇类（flavonols）、黄酮类（flavones）、黄烷酮类（flavanones）、黄烷醇类（flavanols）、异黄酮类（isoflavones）和花色苷类（anthocyanins）等。酚酸一般分为羟基苯甲酸和羟基肉桂酸，在咖啡、核桃、李子以及蓝莓中含量较高［4］。木脂素主要存在于亚麻籽和芝麻籽中［5］。而芪类的代表物质是白藜芦醇。这些多酚类物质因羟基化位置、糖基化、酯化以及多聚化程度不同而具有高度的结构多样性。膳食多酚进入体内后只有一小部分被吸收，且吸收的速度和程度依分子结构的不同而有很大不同。在吸收的过程中，多酚在小肠和肝脏中被代谢为甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等结合形式的代谢物并到达血液和组织。大部分多酚类物质在肠道被肠道菌群分解代谢，主要包括去糖基化，环状结构破坏，生成酚酸和醛等［6］。多酚类物质半衰期较短，一般在摄入数小时（1～12 h）后达到血浆最高浓度［7］。

2 多酚类物质与CVD

大量观察性研究和流行病学研究结果表明，摄入富含多酚类物质的食物和膳食补充剂可以降低CVD等的发病风险［8］，其中比较明确的机制是通过抗氧化、降低血压和改善血管内皮功能等实现。一些短期干预研究提示，补充多酚提取物、或者增加富含多酚类物质食物的摄入，能够提高血清总抗氧化能力、改善CVD危险因素实验室指标，降低CVD的发病风险［9］。摄入富含黄酮类的食物如茶、红酒、可可和大豆等可以改善心脑血管疾病患者，以及有或无CVD危险因素的健康志愿者的内皮功能，其中富含黄酮类的可可产品如黑巧克力可以控制高血压患者和健康个体的舒张压和收缩压［10］。多酚类物质降脂研究的结果不尽一致。绿茶及其所含的儿茶素，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯可能通过抑制小肠脂肪吸收的关键步骤起到降低LDL的作用［11］，而其他富含多酚的物质，如花青素提取物、巧克力及可可、红酒或葡萄等则没有降低LDL的作用［9］。一项研究发现食用富含多酚类物质的橄榄油能增加HDL颗粒大小和HDL介导的细胞胆固醇流出，从而促进HDL抗动脉粥样硬化功能［12］。 Cassidy等［13］对 93 600 例 25 岁至 42 岁的女性进行了长达18年的随访研究，探讨花青素类和其他类黄酮类物质与心肌梗死的关系。黄酮类物质的摄入根据美国农业部的数据库和食物频率调查表进行计算，每4年收集一次。研究结果显示，高花青素摄入与心肌梗死呈显著负相关，与花青素摄入量较低的人群相比，每周食用三次以上富含花青素食物的人群心肌梗死的风险明显降低。多酚类物质对CVD的作用主要被归于其抗氧化功能，但是，根据近期的研究结果，多酚的作用机制很可能包括与分子信号通路和调节细胞过程（如炎症）的分子之间的相互作用，从而影响动脉粥样硬化的发生和发展，如影响全身炎症性反应、脂质代谢和凝血等［7，14］。

虽然许多流行病学研究结果支持增加多酚类物质、或者富含多酚类物质食物的摄入能够降低CVD的发病率和病死率，但也有一些结果不支持这种有益作用。Li等［15］发现摄入富含绿原酸的咖啡豆不能降低高脂饮食引起的小鼠的肥胖、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗等，同时体外试验中对于氧化物质介导的内皮损伤也不具有保护作用。Lin等［16］对66 360例女性进行了12年随访，共发现938例非致死性心肌梗死和324例冠心病致死病例，但黄酮醇或黄酮的摄入量与非致死性心肌梗死或冠心病死亡风险无关。Semba等［17］通过前瞻性队列研究，对1998—2009年基安蒂地区的783例65岁及以上的社区人群进行了调查，探讨白藜芦醇的摄入与CVD和全因死亡的关系，结果发现尿液中白藜芦醇代谢物的浓度与心血管事件等没有显著相关。

3 多酚类物质生物学标志物

目前评价多酚类物质摄入的方法主要为传统膳食调查法。膳食调查法需要受试者对每天摄入食物的种类和数量进行回顾或者记录，再根据食物成分表查询并计算出每日摄入的多酚含量。显然，这种方法会因为回忆偏差、食物分量、同类食物多酚含量的差别，烹饪方式以及某些食物多酚数据的缺乏等，而引入较大的误差。而且，目前仅有美国农业部和欧洲的少数组织和研究机构建立了部分食物的相关数据库［13，18-19］，尚缺乏完整的食物多酚数据库。以上因素均会导致过低或过高地估计多酚类物质的摄入水平，继而影响流行病学研究中评估多酚类物质与疾病之间的关系。用代表多酚类物质摄入的体内代谢产物作为生物学标志物来评价多酚的摄入水平，可以显著降低由膳食评估和食物营养组成引入的误差，更好地评价摄入与疾病的关系，发现用传统方法难以发现的问题。另外，由于个体间吸收代谢的差异很大，生物标志物可以更直接地反映体内组织的暴露情况。由于化学结构的多样性，不同多酚的生物利用度和生物活性有很大的差异，生物标志物的浓度不但能够反映短期内多酚类物质的摄入情况，还可以反映膳食多酚的生物利用度。生物学标志物的发现和检测依赖于合适的分析工具。液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）由于具有高度特异性和灵敏度，近年来被广泛用于多酚生物学标志物的研究。

Urpi-Sarda等［20］对尿液中白藜芦醇的代谢产物进行了鉴别和测定。5例健康男性志愿者在饮用250 ml红酒4 h后留取尿液样本，经LC/MS/MS鉴别出尿液样本中反式和顺式白藜芦醇的3-、4-葡萄糖醛酸酯以及3-、4-硫酸酯，发现这些代谢物可以作为饮酒的生物学标志物，可用于评价干预研究中的依从性，以及流行病学研究中反映饮酒的客观指标，为多酚类物质生物学标志物的选择提供了依据。Grun等［21］设计以安慰剂为对照的随机双盲交叉试验，分析经肠道微生物代谢的黄酮类化合物的生物利用度。受试人群服用富含多酚类物质的红酒或葡萄籽提取物或是空白安慰剂，收集的尿液样本经β-D-葡萄糖醛酸酶处理后，通过GC/MS进行分析，可以检测出浓度在0.1 μg/ml以上的大部分酚酸。Llorach等［19］运用非靶向代谢组学的方法，对食用杏仁皮提取物志愿者的尿液进行了分析，鉴别出包括多酚原形以及肠道代谢物在内的34种物质，发现羟基戊酸、羟基苯基丙酸以及羟基苯乙酸可以作为摄入杏仁皮后的潜在多酚生物学标记，这项研究也证实了多酚类物质经肠道微生物代谢过程的重要性。Mennen等［22］用LC/MS/MS测定了正常饮食人群尿液中的13种有代表性的多酚及其代谢物，发现其多酚水平与饮食习惯、多酚代谢，以及多酚的食物来源等相关，提示这些多酚物质是有潜在应用价值的多酚生物学标志物。另外，白藜芦醇代谢物、烷基间苯二酚、表没食子儿茶素可分别作为红酒、全谷和茶的标志物。尽管报道的多酚生物学标志物很多，但是除了反映大豆摄入的大豆异黄酮及其代谢物以外，这些标志物多没有在不同人群大样本中经过验证。

4 多酚生物学标志物研究存在的问题及前景

尽管将代谢产物作为生物学标志物具有明显优势，但目前仍存在一些困难和不足。多酚类物质种类繁多，生物个体之间差异较大，体内的吸收代谢转归受许多因素的影响，具有多样性和复杂性［23］。首先，多酚类物质进入体内迅速被吸收并代谢，存在肠道为主的首过效应，生物利用度低，且不同的多酚类物质之间的代谢和生物利用度有很大差异。其次，大部分多酚类物质半衰期短（一般血浆中1～12 h，尿中1～5 d），所以浓度受饮食变化的影响较大。再者，大多数的多酚标志物用24 h尿为样本进行测定，但24 h尿不适用于大规模流行病学研究。最后，由于多酚类物质的结合形式或肠道代谢产物缺少标准品，难以准确定量。

尽管如此，现代质谱分析技术和统计学的结合所形成的非靶标-和靶标-代谢组学研究方法仍极大地推动了多酚生物学标志物的研究。非靶标研究有利于发现未知代谢产物及整个代谢谱，而靶标研究可在非靶标的基础上筛选反映摄入与生物学效应的标志物。到目前为止，很多标志物都是在小样本临床研究中，通过一次性单剂量或短期干预得到的。随着分析技术灵敏度和特异度的改进，生物学标志物研究的剂量可望降低到营养水平。由于人们基本上每天都在食用多酚或富含多酚类物质的食物，样本有望使用流行病学研究中常用的血浆或晨尿。另外，所选标志物的有效性需要在较大规模的临床研究或流行病学研究中进行验证。

总之，与膳食问卷相比，多酚生物学标志物可能提供更为准确的暴露情况。筛选并验证有潜在应用价值的评价多酚类物质摄入的生物学标志物、建立准确可靠的测定方法、分析多酚与CVD和CVD危险因素的关系，有助于为营养评估和生活方式干预效果监测提供有效的技术手段，为CVD危险分析提供有应用价值的危险预示指标。