耐药性癫痫患者血浆miRNA分子标志物的初步筛选*

陈 希，张 嘉，赵镭，李丹露，胡宝荣

（哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001）

耐药性癫痫患者血浆miRNA分子标志物的初步筛选*

（哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001）

目的 分析耐药性癫痫患者血浆miRNA表达谱，探讨其变化对诊断耐药性癫痫的价值。方法 利用miRNA芯片技术筛选耐药性癫痫患者（耐药组）、非耐药癫痫患者（控制组）及健康人（对照组）各15例血浆的miRNA表达谱，并分析差异miRNA的生物学功能。结果 耐药组患者血浆与对照组相比，筛选出12个差异表达miRNA，其中7个上调，5个下调；控制组患者血浆与对照组相比，筛选出12个差异表达miRNA，其中6个上调，6个下调；耐药组与控制组相比，筛选出8个差异表达miRNA，其中5个上调，3个下调。结论 通过miRNA芯片技术发现了多个差异表达的miRNA，为探讨耐药性癫痫发病机制及寻找诊断依据提供了参考。

耐药性癫痫；血浆；miRNA；分子标志物

miRNA是一类广泛存在于真核生物中长度约21～25个碱基的非编码小RNA，作为遗传中心法则的重要补充，约占人类基因组的1%，参与基因表达调控，能在不改变转录水平的同时，通过基因沉默对翻译造成抑制作用，继而对生物体的生长、发育产生极为重要的效应［1］。特定的miRNA表达谱能为疾病的诊断提供新型诊断指标。癫痫是一种由多种病因导致的脑部神经元高度同步化异常放电的临床综合征，病因复杂，病理改变多样，其中以苔藓纤维出芽作为主要的病理表现，能导致局部异常神经环路，造成癫痫发病［2］。约有30%的患者对抗癫痫药物具有耐药性，癫痫的耐药性作用机理不明确，其死亡率较一般癫痫患者高4～7倍［3］。随着高通量技术的广泛应用，对耐药性癫痫患者血浆采用miRNA微阵列芯片筛选出差异性表达的miRNA，可以确定一个到几个耐药性癫痫早期诊断的分子标志物，为耐药性癫痫患者的早期诊断、病情监测和预后提供试验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取研究对象45例，年龄14～35岁，平均（25.17±7.62）岁；男26例，女19例。其中，以健康志愿者15例作为对照组，均为无中枢神经系统疾病史和家族史的志愿者，并签署知情同意书。30例癫痫患者中，15例耐药性癫痫患者作为耐药组，抗癫痫药物血药浓度达到正常范围值，且符合以下条件：癫痫发病类型符合国际抗癫痫联盟1981年癫痫发作分类标准；规则服用丙戊酸、苯妥英钠、马西平、苯巴比妥等一线抗癫痫药物2年或2年以上，癫痫发生频率无显著改善；手术中皮层脑电图能明确记录到痫样放电；排除颅内占位性病变及其他神经系统疾病患者。另15例非耐药性癫痫患者作为控制组，抗癫痫药物血药浓度达到正常范围值，规则服用丙戊酸、苯妥英钠、马西平、苯巴比妥等一线抗癫痫药物2年或2年以上，癫痫发生频率明显减少至原来的50%以下，病情得到明显控制。本研究经医院伦理委员会批准，采集参与对象空腹静脉血5 mL于抗凝管中，冷冻保存备用。

1.2 仪器与试剂

miRNA Complete Labeling ang Hyb Kit，Affymetrix miRNA Microarray，Gene Expression Wash Buffer Kit均购自Affymetrix公司；mirVana RNA Isolation Kit购自Ambion公司；RNase－Free Dnase Set（50），miScript Reverse Transcription Kit，Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix均购自Qiagen公司。梯度PCR仪（Bio－Rad）；GeneChip Scanner 3000芯片扫描仪，低温高速离心机（Beckman公司）。

1.3 方法

血浆RNA抽提：取400 μL血浆，使用mirVanaTM RNA Isolation试剂盒抽提总RNA，依照试剂盒说明书操作，采用分光光度计测定所提取RNA的质量。

加poly－A尾巴与荧光标记连接：将1 μg RNA，7 μL DEPC水，2 μL RNA Spike Control Oligospoly，5 μL ATP浓度为1 mmol／L Tris的溶液混合后快速离心。向上述溶液加入1.5 μL 25 mmol／L MnCl2，1.5 μL 10×reaction buffer，1.0 μL酸性磷酸酶，1.0 μL diluted ATP Mix后37℃孵育15 min；荧光标记连接，取上述混合物15 μL快速离心后置冰浴上，加入2 μL T4DNA连接酶，4 μL 5× FlashTag连接Mix生物素，混匀后快速离心，25℃孵育0.5 h。

芯片杂交：采用Affymetrix公司miRNA芯片试剂盒，遵从试剂盒说明书进行操作。杂交液的配制，50 μL 2×杂交Mix，5 μL 20×杂交对照物，5 μL去离子甲酰胺，10 μL DEPC水，1.7 μL对照物寡聚核苷酸B2及10 μL二甲基亚砜。将上述杂交液与生物素样本混合后99℃孵育5 min，45℃孵育5 min，取100 μL用于微阵列杂交，48℃，60 r／min孵育16 h。

数据获得：显色后用GeneChip Scanner 3000芯片扫描仪扫描，提取数据。应用SAM软件进行数据分析，初步筛选耐药性癫痫患者血浆中，与控制组和对照组相比有差异性表达的miRNA。

miR－146a表达验证：按照qPCR逆转录试剂盒说明书，20 μL反应体系，37℃孵育60 min，95℃温育5 min终止反应，逆转录成cDNA后－20℃储存备用。遵照qPCR试剂盒说明书，20 μL反应体系，95℃预变性2 min，40个循环，反应条件为95℃，15 s及60℃，60 s。通过ABI 7500定量PCR仪获得Ct值，单个反应重复2次。

2 结果

2.1 3组的miRNA差异分析

通过对各组血浆miRNA芯片结果的分析显示，与对照组相比，耐药组有7个miRNA表达上调，分别为miR－207，miR－877，miR－146a，miR－467，miR－511，miR－451，miR－146a－5p；5个表达下调，分别为miR－150，miR－193，miR－122，miR－32，miR－222－3p。控制组中有6个表达上调，分别为miR－133b，miR－299，miR－450b－5p，miR－547，miR－574－3p，miR－511；6个表达下调，分别为miR－124，miR－590－3p，miR－32，miR－219，miR－200a，miR－551b。

2.2 控制组与耐药组的miRNA差异分析

通过对耐药组和控制组血浆miRNA芯片结果的分析显示，与控制组相比，耐药组血浆miRNA中有5个表达上调，分别为miR－486－3p，miR－502－3p，miR－98－5p，miR－93－5p，miR－222－3p；3个表达下调，分别为 miR－181a－3p，miR－137，miR－582－3p。

2.3 miR－146a表达qPCR验证

对各组患者血浆中miR－146a进行qPCR验证，结果显示，耐药组中表达量为（3.16±0.67）×2－△Ct，显著高于控制组的（1.57±0.36）×2－△Ct和对照组的（0.79±0.55）×2－△Ct，差异显著（t＝8.09，t＝4.59，P＜0.05）。

3 讨论

随着治疗癫痫的新型药物不断问世，癫痫的治疗效果有了显著提高，但有的患者对抗癫痫药物不敏感，治疗效果仍不理想［4］。这类耐药性癫痫患者在给予常规一线抗癫痫药物治疗后，虽其血药浓度及耐受最大剂量达到了有效范围值，但癫痫仍时常发作［5］。研究发现，在对一种抗癫痫药物有耐药的患者，给予其他作用机制不同的抗癫痫药物治疗，绝大多数患者仍表现出耐药性，仅有不到10%患者的病情得到了有效控制［6］，临床上成为多药耐药，即一种药物导致的耐药性，对其他作用机制不同的药物也产生耐药性。由此可见，耐药性癫痫患者多表现出的耐药性极有可能存在一种非特异性、共同的耐药机制，使癫痫患者脑组织中癫痫灶部位抗癫痫药物的浓度处于较低水平，从而导致疗效差或耐药性，但与该类的作用位点关系很小［7］。分子生物学技术的发展，便可从多种组织学技术角度去探究耐药性癫痫的发病机制，这成为当今攻克癫痫病因的重要研究课题。

研究认为，P－糖蛋白（P－gp）可能参与了癫痫耐药的机制。国内外的相关研究也已证实，很多AEDs均为上述耐药蛋白的底物，而且P－gp在难治性癫痫患者脑组织和血浆中呈高表达［8］。已有研究表明，miR－27a与miR－451可在肿瘤细胞中调节P－gp的表达［9］。另外，应用Targetscan microRNA靶点预测网站，发现也有很多miRNA可以靶向P－gp，如miR－1，miR－137等。

本研究通过miRNA芯片获得耐药性癫痫患者、控制性癫痫患者和非癫痫者血浆miRNA表达谱，通过比较分析，发现了多个差异miRNA。通过对各组血浆miRNA芯片结果进行分析，结果显示，耐药组与对照组相比，有7个miRNA表达上调，有5个miRNA表达下调；控制组中有6个miRNA表达上调，有6个miRNA下调；与控制组相比，耐药组血浆有5个miRNA表达上调，有3个miRNA下调。miR－124是大脑较丰富表达的一类miRNA，参与神经元的发育及分化，调节突触的可塑性［10－11］。miR－124在癫痫异常神经网络中调节神经再生及突出生长，通过抑制cAMP反应元件结合蛋白的表达，而后者所参与激活的下游基因可能参与了癫痫的发作过程［12］。Manna等［13］的研究结果显示，miR－146a在星形胶质细胞激活区大量表达，由于癫痫发作而导致其细胞激活区高度表达miR－146a，提示其可能涉及颞叶癫痫发生中胶质细胞介导的炎性反应。

总之，本研究中针对耐药性癫痫患者、非耐药性患者及健康者的血浆miRNA谱进行分析，寻找耐药癫痫患者血浆miRNA分子标志物，发现了多个差异表达的miRNA，为深入探讨耐药性癫痫发病机制及寻找诊断依据提供了参考。

［1］夏海滨，李 星.miRNA在肿瘤发生、诊断及治疗中的研究进展［J］.陕西师范大学学报：自然科学版，2013，41（5）：63－67.

［2］常 伟，潘立平，吴秋静，等.miR－204对癫痫神经元中BDNF／TrkB信号通路的影响［J］.天津医药，2014，56（3）：214－216.

［3］李乐超，张燕芳.耐药性部分性发作癫痫抗癫痫药物治疗观察及影响因素分析［J］.山东医药，2013，53（23）：24－26.

［4］钟 坚，胡登科，任 惠，等.耐药性（难治性）癫痫研究进展［J］.长江大学学报：自然科学版，2011，8（2）：208－212.

［5］肖慧媚，廖建湘，蒋 莉，等.微小核糖核酸miR－146a－5p、miR－23a－3p在儿童耐药性癫痫血清中的表达［J］.中国神经精神疾病杂志，2013，39（8）：500－503.

［6］Kumari R，Lakhan R，Garg RK，et al.Pharmacogenomic association study on the role of drug metabolizing，drug transporters and drug target gene polymorphisms in drug－resistant epilepsy in a north Indian population［J］. Indian J Hum Genet，2011，17（Suppl 1）：32－40.

［7］Aronica E，Sisodiya SM，Gorter JA.Cerebral expression of drug transporters in epilepsy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2012，64（10）：919－929.

［8］Seven M，Batar B，Unal S，et al.The drug－transporter gene MDR1 C3435T and G2677T／A polymorphisms and the risk of multidrug－resistant epilepsy in Turkish children［J］.Mol Biol Rep，2014，41（1）：331－336.

［9］Zhu H，Wu H，Lin X，et al.Role of MicroRNA miR－27a and miR－451 in the regulation of MDR1／P－glycoprotein expression in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76（5）：582－588.

［10］Gu X，Meng S，Liu S，et al.miR－124 represses ROCK1 expression to promote neurite elongation through activation of the PI3K／Akt signal pathway［J］.J Mol Neurosci，2014，52（1）：156－165.

［11］Gao FB.Context－dependent functions of specific microRNAs in neuronal development［J］.Neural Dev，2010（5）：25.

［12］Hedrich CM，Crispin JC，Rauen T，et al.cAMP－responsive element modulator α（CREMα）trans－represses the transmembrane glycoprotein CD8and contributes to the generation of CD3＋，CD4－，CD8－T cells in health and disease［J］.J Biol Chem，2014，289（4）：2 361－2 370.

［13］Manna I，Labate A，Mumoli L，et al.Relationship between genetic variant in pre－microRNA－146a and genetic predisposition to temporal lobe epilepsy：a case－control study［J］.Gene，2013，516（1）：181－183.

Preliminary Screening of Pasma miRNA Molecules Markers in Patients with Drug-Resistant Epilepsy

Chen Xi，Zhang Jia，Zhao Yilei，Li Danlu，Hu Baorong
（Department of Pharmacy，First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin，Heilongjiang，China 150001）

ObjectiveTo analyze the plasma miRNA expression profiling in the patients with drug-resistant epilepsy and investigate the value of the miRNA expression profiling change in diagnosing drug-resistant epilepsy.MethodsThe miRNA microarray technique was adopted to screen the plasma miRNA expression profiling in the patients with drug-resistant epilepsy，patients with non-drug-resistant epilepsy and healthy people.The biological function of difference miRNA was analyzed.ResultsCompared with the control group，12 differentially expressed miRNA in the drug-resistant epilepsy group were screened out，in which 7 miRNA were up-regulated，5 miRNA were down-regulated；compared with the control group，12 differentially expressed miRNA in the epilepsy control group were screened out，in which 6 miRNA were up-regulated and 6 miRNA were down-regulated；compared with the epilepsy control group，8 differentially expressed miRNA in the drug-resistantgroup were screened out，in which 5 miRNA were up-regulated and 3 miRNA were down-regulated.ConclusionMultiple differentially expressed miRNA are discovered by the miRNA microarray technique，which provides reference for further researching the pathogenesis of drug-resistant epilepsy and seeking the diagnosis basis.

drug-resistant epilepsy；plasma；miRNA；molecules markers

R446.1；R749.1＋7；R966

A

1006－4931（2015）02－0019－02

2014－05－12）

*哈尔滨医科大学附属第一医院基金资助项目，项目编号：2013Y05。