曲古抑菌素A在肿瘤免疫治疗中的作用及机制

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.006

基金项目：国家自然科学基金海外及港澳学者合作研究基金（31428005）；国家自然科学基金（81171653、30950022）；江苏省自然科学基金（BK2011246）；江苏省条件建设与民生科技专项资金（BL2014034）

作者单位：213003 常州，苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心

通信作者：蒋敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

收稿日期：2015-06-08

表观遗传学（epigenetic）修饰是基因表达调控的重要形式之一，即在不改变特定基因核苷酸序列的情况下，通过DNA 的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化的共价修饰作用使基因表达发生可遗传的变化，从而改变细胞功能 [1]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）是基于表观遗传学理论发现的一类新型抗肿瘤药物，因其广谱、高效、低毒，抗肿瘤效果良好，具有较好的应用前景。曲古抑菌素 A（trichostatin A，TSA）来源于链霉菌代谢产物，是最早被应用于临床抗肿瘤治疗的 HDACi 家族成员之一。TSA 以组蛋白去乙酰化酶（HDAC）为靶点，通过抑制 HDAC 的活性，有效上调细胞中组蛋白乙酰化水平，促进细胞分化，阻滞细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，从而促进抗肿瘤转录因子的转录及表达，调控相关信号通路，发挥抗肿瘤效应 [2]。

肿瘤免疫治疗（cancer immunotherapy）是继手术、化疗、放疗后第四种肿瘤综合治疗手段，因其能改善患者肿瘤微环境，提高机体抗肿瘤免疫反应，且毒副作用小，与手术等其他治疗手段协同效果好，受到越来越多的关注 [3]。有学者认为，未来大部分肿瘤患者将主要接受免疫治疗 [4]。尽管肿瘤免疫治疗应用前景广阔，但由肿瘤相关的免疫抑制细胞（如 Treg、MDSCs）及免疫抑制因子（如 TGF-β、PD-L1、FasL）等引起的肿瘤免疫耐受是肿瘤免疫治疗失败的常见原因。因此，肿瘤的综合治疗模式仍是目前肿瘤治疗的主要研究方向。TSA 以往主要应用于抗肿瘤的基础研究及临床药物试验，近期研究表明，TSA 在多项肿瘤联合免疫治疗中均显示出较强的协同及增强作用，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。现就 TSA 在肿瘤免疫治疗中的作用及机制综述如下。

1　生物学特点与功能

组蛋白乙酰化是组蛋白共价修饰的形式之一。组蛋白乙酰基转移酶（HAT）通过改变核小体结构，使组蛋白染色质结构疏松，进而开启基因的转录、表达 [5]。HDAC 作用则正好相反，在其影响下组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基被移去，使染色质与组蛋白结合得更紧密，引起基因转录抑制 [6]。两者共同维持乙酰化正常水平。

TSA 是一种强效、特异并且可逆的 HDAC 抑制剂，为氧肟酸盐类化合物，是第一个被发现能抑制 HDAC 的天然氧肟酸，可作用于第 I、II 类 HDAC。TSA 主要通过其氧肟酸基团与底物竞争性结合 HDAC 上的锌离子，使HDAC 失活，从而发挥抑制作用。研究证实，TSA 可持续诱导 p21 基因表达上调，这与该基因启动子 HDAC 和c-myc 结合减少有关 [7]。TSA 在提高多种抑癌转录因子乙酰化水平的同时，也能抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。

2　抗肿瘤作用机制

2.1 阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡

TSA 通过上调细胞周期蛋白激酶（CDK）抑制剂 p21、p27 的表达以及下调细胞周期蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin D2 的含量，抑制 CDK 的活化，从而使肿瘤细胞停滞在 G1 或 G2 期，阻滞肿瘤细胞继续生长 [8]。Alao 等 [9]研究表明，TSA 可以在 MCF-7 系乳腺癌细胞中迅速降解cyclin D1，使乳腺癌细胞的细胞周期停滞于 G0/G1 期。Noh 等 [10]报道，TSA 作用于 HeLa 细胞时可以降低 cyclin B1、PLKl 和 survivin 蛋白表达水平，同时上调 p21 的表达，导致细胞周期停滞于 G2/M 期。

TSA 主要通过外源性及内源性两条途径介导细胞凋亡。外源性途径主要通过上调多种死亡受体，如 TRAIL、FasL、TNF 等，激活肿瘤细胞与相应配体的结合，诱导caspase-3 及 caspase-8 介导的细胞凋亡通路，导致细胞凋亡。内源性途径通过释放线粒体间膜蛋白显著降低线粒体间膜电位，从而激活 caspase 途径，诱导细胞凋亡。Taghiyev 等 [11]研究发现，TSA 通过激活 caspase-9 途径，导致线粒体释放细胞色素 C 和线粒体间膜蛋白，通过线粒体途径诱导凋亡的发生，研究者预先阻断 caspase-9 激活途径，导致细胞抵抗 TSA 诱导的凋亡，表明线粒体途径在 TSA 诱导细胞凋亡中的重要作用。

2.2 抑制肿瘤血管生成

肿瘤的生成大多与微环境缺氧有关。在缺氧的情况下，由于 HDAC 过度表达导致抑癌基因 p53 和 VHL 转录受阻，引起缺氧诱导因子 HIF-1α 和血管内皮生长因子 VEGF过度表达，促进肿瘤血管生成 [12]。研究表明，TSA 主要通过下调因缺氧而导致的肿瘤血管生成相关基因的表达以及直接抑制内皮细胞的迁移和增殖，从而抑制肿瘤血管生成 [13]。Yang 等 [13]发现在人骨肉瘤中，TSA 通过抑制 HIF-1α 及 VEGF 的表达，诱导其受体降解，并通过上调 p53 和VHL 的转录，从而抑制肿瘤血管生成。同时，TSA 亦能上调 VEGF 抵抗剂 sema-phorin 3 的表达。

2.3 诱导肿瘤细胞分化

TSA 能在不杀伤肿瘤细胞的情况下，诱导去分化肿瘤细胞向正常细胞方向分化。目前研究表明，TSA 对包括乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌等在内的多种肿瘤细胞具有诱导分化的能力。Uchida 等 [14]证实，TSA 可通过诱导阶段特异性蛋白 glycodelin 的表达，促进人子宫内膜癌细胞的分化。Rahman 等 [15]用 TSA 作用于髓系白血病细胞株 RAW264，发现 TSA 促进细胞向巨噬细胞分化而不向破骨细胞分化。

3　在肿瘤免疫治疗中的作用

TSA 不仅对肿瘤细胞有直接的细胞毒作用，更在机体免疫系统中发挥多种免疫调节作用，促进抗肿瘤免疫疗效。时玉舫团队揭示了 TSA 通过抑制肿瘤浸润 T 细胞凋亡，提高抗肿瘤免疫效应，能有效抑制肿瘤生长 [16]。进一步研究发现，TSA 通过抑制 Fas-FasL 通路介导的免疫细胞“激活诱导的细胞凋亡（activation-induced cell death，AICD）”过程减少细胞死亡，从而抑制下游凋亡信号的激活。同时，他们团队还发现 TSA 和 CTLA4 单抗的联合应用可极大地促进 CD4 +T 细胞的浸润，发挥抗肿瘤免疫治疗的协同作用 [16]。

3.1 促进肿瘤细胞被免疫细胞识别

对肿瘤细胞的识别和清除主要由肿瘤特异性 T 细胞执行，除此之外，还依赖于肿瘤相关抗原（TAAs）以及 MHC I 类分子的表达水平。TSA 可以通过上调 MHC I 类分子、共刺激分子以及黏附分子的表达水平提高肿瘤细胞的免疫原性，导致 IFN-γ 分泌 T 细胞的活化 [17]并增强 CTL 细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 [18]。在小鼠浆细胞瘤研究中还证实，TSA 通过激活 pIII-CIITA 启动子诱导 MHC II 类分子的表达，导致 CD4 +T 细胞的扩增 [19]。此外，TSA 能够在抗原肽缺陷小鼠的细胞系中增加或诱导抗原肽转运基因TAP-1、TAP-2 以及 LMP-2 的表达 [20]。NK 细胞通过活化受体 NKG2D 与其配体 MICA/MICB、ULBPs 的识别途径清除肿瘤细胞，发挥抗肿瘤免疫效应。TSA 诱导肿瘤细胞表面 MICA/MICB 高表达，促进 NK 细胞对肿瘤细胞的识别 [21]。López-Soto 等 [22]发现 TSA 可以促进 ULBPs 在上皮细胞瘤中的表达。

3.2 对抗原提呈细胞以及细胞因子的作用

抗原提呈细胞（APC）既是固有免疫的一部分，又能通过双信号途径激活 T 细胞，因此 APC 又是获得性免疫的启动者。而促炎细胞因子的释放是许多疾病发生和发展的原因。HDACi 多次被证实阻碍 APC 协同刺激能力和促炎性细胞因子的产生。在小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和树突状细胞（BMDC）中，TSA 能显著下调共刺激分子的表达以及细胞因子的产生 [23-24]。该研究中，BMDC 经由TSA 处理后，其表达的共刺激分子 CD40、CD80、CD86、CCR 与促炎性细胞因子 IL-6、IL-12、TNF-α 均被下调 [24]。然而，在腹膜巨噬细胞中，TSA 上调 IL-12 的同时下调IL-10 的表达 [25]。对于两种截然不同的研究结果，一种假说是 TSA 加入的时间点不同，第一组实验 TSA 在抗原提呈细胞被激活前 1 小时加入，第二组实验 TSA 与激活剂同时加入。可见抗原提呈细胞的活化与否对 TSA 产生了不同的影响。与其形成鲜明对比的另一种假说是，TSA 在BMDM 中不仅没有下调 IL-12 的表达，相反可以防止IL-12 减少的产生。另有研究报道，TSA 通过减少促炎性细胞因子的产生下调小鼠全身性炎症反应 [26]。相似的效果在人类巨噬细胞和树突状细胞中也有呈现。此外，TSA 还影响转录因子的活化。Nencioni 等 [27]研究发现，在单核细胞来源的 DC 细胞中，TSA 通过阻断 NF-κB 和 I 型 IFN信号通路减少细胞因子的产生，并抑制 DC 的分化和功能。除此之外，在人类肿瘤细胞系和小鼠外周血中同时发现，TSA 可以减少促肿瘤生成细胞因子巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的产生 [28]。总而言之，TSA 通过减少共刺激分子的表达以及促炎性细胞因子的产生来抑制抗原提呈细胞的功能。

3.3 TSA 对效应淋巴细胞的作用

CD4 +效应 T 细胞是适应性抗肿瘤免疫应答的重要组成部分。研究显示，HDACi 对 CD4 +细胞的细胞活性与功能具有抑制作用。Moreira 等 [29]用 TSA 处理小鼠 CD4 +细胞后发现，TSA 能够抑制 PMA/ionomycin 刺激转录因子NF-κB 被转运到细胞核内，促进 NF-κB 依赖的基因转录的能力，并伴随时间的延长损害 CD4 +细胞的活性。TSA能够影响 CD4 +细胞表面特异性抗原的表达，这与其上调细胞周期性蛋白依赖性激酶抑制因子 p21 表达有关 [30]。以上研究均显示 TSA 妨碍 CD4 +细胞抗肿瘤免疫应答的产生。

在有效的抗肿瘤免疫应答中，CD8 +效应 T 细胞的细胞毒性作用是至关重要的。一些研究显示，HDACi 能增强CD8 +细胞的功能。TSA 能够上调与 CD8 +活化和产生免疫记忆性相关基因的表达水平 [31]。研究表明，记忆性 CD8 +细胞产生 IFN-γ 的能力依赖于 CD4 +辅助性细胞的存在，并且只有在 CD8 +记忆性 T 细胞中，IFN-γ 位点才能被高度乙酰化从而分泌大量 IFN-γ，迅速启动抗肿瘤免疫功能[32]。

尽管 HDACi 抗肿瘤作用之一来源于 NK 细胞对肿瘤的识别能力，但是 HDACi 对 NK 细胞自身的作用报道并不多。Ogbomo 等 [33]首次证实联合使用 HDACi 与 IL-2 可通过下调 NK 细胞活化受体相关激活信号通路从而抑制人类 NK 细胞的增殖能力和细胞毒性作用。另一项研究同时证实，HDACi 对 NK 细胞功能的影响并非由于其诱导 NK细胞凋亡所致，NK 细胞仍能通过释放穿孔素、颗粒酶杀伤肿瘤细胞 [34]。Rossi 等 [35]研究发现，TSA 抑制由 IL-12、IL-15 以及 IL-18 激活的 CD56dim/bright NK 细胞 IFN-γ的产生，并削弱 NK 细胞对 K562 细胞的细胞毒性作用。同时 TSA 可持续下调静止或活化的 NK 细胞表面受体NKG2D 以及 NKp46 的表达，并减少 NK 细胞表面分子CD25 的表达，导致其对 IL-2 的激活作用反应迟钝。该研究提示我们，以 TSA 为代表的 HDACi 在治疗过程中对NK 细胞有一定的负性调节作用，可能会削弱机体的免疫监视功能导致肿瘤复发。

3.4 对调节性免疫细胞的作用

调节性免疫细胞是一类控制自身免疫反应的细胞群体，包括 Treg 细胞、MDSC 细胞以及肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等。当肿瘤发生时，这些细胞有利于机体肿瘤免疫抑制微环境的形成，抑制抗肿瘤免疫反应。Foxp3 叉状头结构区赖氨酸的高度乙酰化有利于 Treg 细胞获得最佳功能，Foxp3 乙酰化后可以增强与 IL-2 启动子的结合，从而抑制 IL-2 的表达。Doñas 等 [36]发现 TSA 可增强 Foxp3基因的表达，促进 Treg 细胞分化及增殖并增强其免疫抑制能力。MDSC 细胞是未成熟的骨髓细胞，对 T 细胞抗肿瘤免疫应答有积极的抑制作用。Rosborough 等 [37]发现联合使用 TSA 及 GM-CSF 与单独使用 GM-CSF 干预小鼠骨髓前体细胞培养 7 d 后，两组细胞分化差异极大，TSA 能够促进 MDSC 细胞的分化和增殖，表明组蛋白乙酰化能够调节髓系细胞向 MDSC 细胞分化。TAM 细胞表面 MHC II类分子低表达，与肿瘤进展有关。有关研究证实，TAM 细胞对 TSA 的作用相当敏感，TSA 可以恢复 TAM 细胞MHC II 类分子的表达，逆转免疫抑制功能，延缓肿瘤的生长 [38]。总之，TSA 对调节性免疫细胞的作用不尽相同，特别是其在肿瘤中对 MDSC 细胞和 TAM 细胞的作用需要进一步探讨。

4　展望

以 TSA 为代表的 HDACi 对机体免疫功能既有促进作用也有抑制作用，其正性或负性作用的产生取决于免疫细胞的类型和活化状态。尽管 TSA 对一些免疫细胞的细胞活性和功能有负性调节作用，但越来越多的证据表明 TSA 与其他肿瘤免疫治疗手段联合使用能够发挥较强的协同抗瘤作用。TSA 诱导肿瘤细胞特异性凋亡直接导致瘤体缩小，并且可以缓解机体免疫抑制状态，促使肿瘤细胞更易被 NK细胞和 T 细胞识别。综上所述，TSA 与肿瘤免疫治疗的联合使用前景广阔，但两者发挥协同作用的机制还需进一步探讨。