协同刺激分子B7-H6生物学特性及其在肿瘤中的意义

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.009

基金项目：国家自然科学基金海外及港澳学者合作研究基金（31428005）；国家自然科学基金（81171653、30950022）；江苏省自然科学基金（BK2011246）；江苏省科技条件建设与民生科技专项资金（BL2014034）

作者单位：213003 常州，苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心

通信作者：蒋敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

收稿日期：2015-06-08

自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）是固有免疫系统的重要组成部分，通过释放趋化因子和细胞因子，广泛参与炎症反应与适应性免疫应答，在抗肿瘤、抗病毒感染以及干细胞移植等方面发挥重要作用 [1]。NK 细胞的活化取决于其细胞表面活化信号及抑制信号的共同调控。NKp30 是自然细胞毒性受体（natural cytotoxicity receptors，NCR）家族成员之一，是 NK 细胞表面重要的活化性受体，通过识别靶细胞上相关配体，介导 NK 细胞发挥生物学功能。B7-H6是新发现的协同刺激分子 B7 家族成员，作为 NKp30 的潜在配体，能够激活 NKp30 介导的 NK 细胞活化，促使其分泌细胞因子，发挥抗肿瘤细胞毒性 [2]。B7-H6 是 B7 家族首个被证实能够直接诱导 NK 细胞活化的协同刺激分子，在部分肿瘤组织中有表达，正常组织中不表达，这一发现为揭示 NKp30 在肿瘤免疫监视中的作用提供了新的依据。

1　协同刺激分子 B7-H6 的生物学特性

Brandt 等 [3]最先研究发现 NKp30 Fc 融合蛋白可以与K562 细胞结合，其特异性结合仅被 NKp30 单克隆抗体阻断，而不被 NKp46 单克隆抗体阻断。并且，NKp30 Fc 融合蛋白能够抑制 NK 细胞对 K562 细胞的结合能力与细胞毒活性。通过免疫沉淀技术对 NKp30 Fc 与 K562 细胞结合后的裂解产物进行沉淀并用凝胶电泳分离，质谱分析其中的差异蛋白，最后由表面等离子金属共振技术（surface plasmon resonance，SPR）确认一种蛋白（DKFZp686O24166）能特异性结合 NKp30，两者结合活性可被能阻断 NKp30介导的 NK 细胞活化的 NKp30 单克隆抗体所抑制。由于该蛋白基因和蛋白结构与 B7 家族其他成员类似，并且其受体 NKp30 与 CD28 家族相关，因此被命名为 B7-H6分子。

B7-H6 基因定位于染色体 11p15.1，在人类 dbEST 数据库中仅有 4 种 cDNA 的表达序列标签（expressed sequence tags，EST）。B7-H6 与 B7 家族成员中 B7-H1、B7-H3 同源性最高，其开放阅读框编码一个分子量为 51 kD 的免疫球蛋白超家族 I 型跨膜糖蛋白。B7-H6 胞外区含有两个由外显子编码的 Ig 结构域，包含 6 个重要的 N 连接糖基化位点。B7-H6 胞内区域与 GAG 多聚蛋白同源性较高，含有多种信号基序，例如免疫受体酪氨酸依赖抑制基序、Src同源性 2 结合基序等，这种特性提示 B7-H6 可通过胞内信号蛋白的交互作用诱导 NK 细胞表面受体活化 [3]。

2　协同刺激分子 B7-H6 的表达情况

小鼠基因的 B7-H6 相关序列仅与人类基因第一外显子相对应，因此 B7-H6 在小鼠基因中表达缺失 [4]。B7-H6 mRNA 在绝大部分人类正常组织中不表达，这一结果与其基因微阵列检测结果一致。用亲和纯化的 B7-H6 抗血清或 B7-H6 单克隆抗体在新鲜分离的人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中未检测到B7-H6 的表达。此外，在植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激后的 PBMC 中也未观察到 B7-H6 的表达。值得注意的是，尽管 NKp30 受体在 NK 细胞和 DC 细胞的交互调控中发挥重要的作用，但是在经 IL-4、GM-CSF刺激诱导而来的静止或活化的 DC 细胞中也未检测到B7-H6 [5]。B7-H6 mRNA 主要表达于不同来源的肿瘤细胞系，包括淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、恶性上皮肿瘤以及其他原发性肿瘤等。在多种血液系统肿瘤患者的肿瘤细胞中也有 B7-H6 的表达。B7-H6 局限于肿瘤组织中表达与 NK细胞在压力诱导模式下启动固有免疫反应的机制吻合 [6]。最新研究发现，B7-H6 除了在肿瘤组织表达外，其基因转录、蛋白表达可在 Toll 样受体激动剂以及促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α 的诱导下于活化的单核细胞和中性粒细胞上表达。这一研究揭示，B7-H6 不仅对肿瘤免疫监视有影响，还能在感染条件下参与机体炎症反应 [7]。

3　协同刺激分子 B7-H6 与其受体 NKp30 的作用通路及调控机制

B7-H6 特异性地在肿瘤细胞中表达，并能被 NKp30识别、诱导 NK 细胞活化。NKp30 基因定位于染色体6p21.32，分子量为 30 kD，与 CTLA-4 有 25% 的同源性，属于免疫球蛋白超家族成员，胞外仅含有一个 IgV 样区域，跨膜区有一个带正电荷的精氨酸残基，通过电荷作用与CD3ζ 链结合从而传递活化信号 [8]。NKp30 主要表达在人静止或活化的 NK 细胞表面，但最近也有研究表明，在 IL-15刺激后的脐带血 T 细胞以及黄体酮干预后的子宫内膜上皮细胞中也有 NKp30 表达 [9-10]。作为 NK 细胞重要的活化性受体，NKp30 与 NKG2D、DNAM-1 等其他受体相同，可以识别多种配体，从而发挥不同的生物学效应 [11]。目前已知热休克因子释放的核蛋白 HLA-B 相关转录因子 3 和人巨细胞病毒 pp56 蛋白能够结合 NKp30，但两者均不在肿瘤细胞中表达。B7-H6 不被 NK 细胞表面 NKp44、NKp46 以及 NKG2D 等活化性受体识别，NKp30 也不与 B7-H1、B7-DC、B7-H3 等 B7 家族成员结合，表明 NKp30 胞外区域能与 B7-H6 胞外区直接并特异性结合。NKp30 通过与 B7-H6IgV 结构域结合形成的复合物主要依赖 NKp30 中 11 个氨基酸残基与 B7-H6 中 12 个氨基酸残基间的疏水作用力，并且 B7-H6 分子 125 ~ 130 位氨基酸形成的loop 环在与 NKp30 结合中发挥重要作用 [12]。

B7-H6/NKp30 途径主要通过诱导 NK 细胞活化、促进其分泌 IL-2 和 IFN-γ 等细胞因子，增强 NK 细胞杀伤能力，参与抗肿瘤免疫反应。Schlecker 等 [13]发现整合素金属蛋白酶 10（adisintegrin and metalloprotease 10，ADAM 10）可以介导肿瘤细胞外 B7-H6 分子的脱落，阻碍 NK 细胞通过 NKp30 受体途径对肿瘤细胞的识别，通过抑制ADAM 10 的活性，能够提高肿瘤细胞 B7-H6 的表达，增强 NKp30 介导的 NK 细胞活化能力。因此，B7-H6/NKp30途径对阻止肿瘤细胞逃避免疫监视发挥重要作用。

B7-H6 的表达主要与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的调节有关。Fiegler 等 [2]证实 I 型组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）可以下调 B7-H6 mRNA 在多种肿瘤细胞系上的表达，同时 I 型 HDACi 在转染小干扰 RNA（siRNA）后，B7-H6 基因表达沉默，从而影响 NK 细胞对肿瘤细胞的识别能力。这些研究表明抑制 B7-H6 表达主要与减少其报告基因活性以及降低启动子乙酰化水平有关。这一研究结果与之前报道的 HDACi 通过增强 NK 细胞活化受体 NKG2D相关配体的表达水平，从而提高 NK 细胞介导的抗肿瘤免疫反应截然相反。由此可见，肿瘤细胞表面不同配体的表达对 HDACi 联合 NK 细胞肿瘤免疫治疗的临床转归有深远影响。

4　协同刺激分子B7-H6在肿瘤治疗中的意义

B7-H6 主要表达在造血系统或非造血系统肿瘤细胞系表面，但对于其在肿瘤组织中的表达情况研究还不够深入。到目前为止，应用免疫组织化学法已在胃癌及非小细胞肺癌等人类肿瘤组织中检测到 B7-H6 蛋白的表达。

Chen 等 [14]检测到 B7-H6 在原发性胃癌中有表达，虽然 B7-H6 在原发性胃癌中的表达与患者临床病理特征和预后没有相关性，但发现 B7-H6 的表达水平与肿瘤细胞的分化程度相关，细胞分化程度越高，B7-H6 蛋白表达水平也越高。Zhang 等 [15]在非小细胞肺癌中检测到了 B7-H6 的表达，并用流式细胞术检测了 B7-H6 受体 NKp30 在组织中的表达情况，结果显示，B7-H6 在肿瘤组织及邻近非肿瘤组织中的表达无统计学意义，且 B7-H6 表达与除细胞分化水平外的其他临床病理特征无相关性，B7-H6 的受体NKp30 在肿瘤组织及邻近非肿瘤组织中表达也无显著差异，这一结论与 Chen 等在胃癌中的研究结果相似。有关B7-H6 蛋白在其他肿瘤组织中的表达有待于研究。

NK 细胞对靶细胞的识别模式之一为“压力诱导”模式（stress-induced mode），是指靶细胞在恶性转化、病毒感染、炎性反应或化学刺激等压力作用下，靶细胞自身蛋白可在转录因子 HSF 的调控下上调表达，从而被 NK 细胞活化受体识别，激活 NK 细胞，发挥杀伤功能。Kellner 等 [16]首先制备出一种包含 B7-H6 分子胞外结构域以及 CD20 抗体单链可变区段 7D8 的重组融合蛋白，该蛋白可以与 CD20 +的淋巴瘤细胞特异性结合，使细胞高表达 B7-H6 分子，并通过 B7-H6/NKp30 途径使 NK 细胞活化并释放颗粒酶、穿孔素溶解靶细胞。

B7-H6 除了在 NK 细胞的活化及生物学功能的发挥中有重要作用，还可以通过基因修饰等途径参与 T 细胞介导的抗肿瘤免疫应答。Zhang 等 [17]报道，利用基因工程技术，将以非 MHC 限制性方式识别目标抗原（B7-H6）的嵌合受体（NKp30）通过激活信号，以病毒载体或转座子系统方式转染 T 细胞，由此制备出的 NKp30-CAR-T 细胞可以不依赖于 MHC 限制性，特异性识别 B7-H6 +的肿瘤细胞，分泌 IFN-γ 并杀伤肿瘤细胞。研究者将这种胞内含有CD28 信号区的 NKp30-CAR-T 细胞过继转移给 B7-H6 +的淋巴瘤小鼠模型，发现其显著抑制小鼠肿瘤的生长。这一研究成果为过继细胞免疫治疗的临床应用提供了新的思路。

5　展望

B7-H6/NKp30 途径的发现揭示了 NK 细胞活化的一种崭新的分子机制。B7-H6 局限在肿瘤组织中表达也是机体在应激压力下诱导自身蛋白表达的一个新发现。目前，对B7-H6 的作用机制尚未明确，在肿瘤患者的纵向研究中，需要探究 B7-H6 在肿瘤组织中的表达不受肿瘤免疫编辑的影响而发生变化，以及 B7-H6 与其受体 NKp30 如何与肿瘤微环境中其他信号分子共同形成复杂的调控网络以调节免疫效应细胞的活化与功能。如果明确 B7-H6 能特异性并稳定地在肿瘤组织中表达，提示将 B7-H6/NKp30 作为肿瘤免疫治疗新靶标有广阔前景，也为肿瘤的临床综合诊疗提供了新的策略。