钙蛋白酶小亚基1在细胞凋亡、细胞周期及肿瘤中作用机制的研究进展

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.010

作者单位：213003 常州，苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心

通信作者：何小舟，Email：hexiaozhouczyy@163.com

收稿日期：2015-06-08

钙蛋白酶（calpain）是一种存在于动物细胞中的钙离子依赖性的中性半胱氨酸蛋白酶。钙蛋白酶小亚基 1 （calpain-s1，capn4）作为 calpain 的调节小亚基，对细胞周期、细胞凋亡及肿瘤的发生、发展等具有一定的影响。本文就近年来有关 capn4 在细胞周期、细胞凋亡及肿瘤中的作用机制作一综述。

1　Calpain 简介

Calpain 是由 Guroff [1]在 1964 年于大鼠的脑组织中首次发现并研究。Calpain1 和 calpain2 存在于哺乳动物中，由于其激活所需的 Ca 2+浓度不同，分为 μ-calpain 和m-calpain。calpain1 和 calpain2 在结构上是由一个 80 kD的大催化亚基和一个 28 kD 的小调节亚基组成 [2]。Calpain参与细胞的增殖、凋亡、迁徙及转移等能力。钙蛋白酶的水解活性是其主要表现，研究表明，calpain 可以通过水解踝蛋白（talin）的 Q433-Q434 位点和 talin-R 端的 K2493-K2494位点来影响整合素的激活和黏着斑的形成 [3-5]。Chan 等 [6]研究表明，calpain 还可以通过水解黏着斑激酶（FAK）的V774G 位点来调节黏附功能中 talin 的动态表达。Paxillin、fodrin、ezrin、vinculin 和 α-actinin 等蛋白都能被 calpain水解从而影响肿瘤细胞的迁徙转移及黏附等功能。

2　Capn4 结构与功能

Capn4 是 calpain 家族共有的一个调节性小亚基，它包含一个由 30% 甘氨酸残基组成的 N 末端结构域 V 和一个与结构域 IV 相似的 C 端的 Ca 2+结合结构域 VI [7-8]，在维持 calpain 功能中起着重要的作用。研究表明，敲除capn4 基因可导致 calpain1 及 calpain2 的失活，并通过影响小鼠心脏发育、形成而造成其在妊娠中期的死亡，提示钙激酶蛋白在生物的生长发育中起到至关重要的作用 [9]。Kashiwagi 等 [10]发现 capn4 的失活可减少小鼠软骨细胞的增殖分化，并在体外试验中证明这种改变是通过降低细胞周期蛋白 D（cyclin D）的基因转入和增加相关细胞周期蛋白的累积来影响细胞从 G1 期向 S 期的过渡。而 Wernimont 等 [11]发现 capn4 基因的缺失对淋巴细胞功能相关抗原-1 （LFA-1）介导的 T 细胞的黏附、增殖、迁徙、生长及免疫突触的形成没有影响，其原因可能是其他亚型 calpain 的补偿作用。在心肌梗死（MI）的研究中，Ma 等 [12]发现 capn4基因的缺失可以限制心肌梗死后左心室的肥大和梗死灶的扩大、减少心肌细胞的凋亡及纤维化，其机制可能是由于capn4 的缺失导致了核因子 κB（NF-κB）抑制蛋白（IκB）的降解从而抑制了 NF-κB 的活性以及后续的炎症因子的释放。近期在肾透明细胞腺癌组织的研究中发现 capn4 的mRNA 水平及蛋白水平均呈过表达，并且与肿瘤的大小及患者的预后有一定关系 [13]。因此，capn4 与细胞的生长、功能及许多疾病存在密切的联系，虽然现在关于 capn4 的相关机制并不是完全清楚，但其可能成为新的治疗靶点和分子标志物。

3　Capn4 与细胞凋亡

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主、有序的死亡。钙激酶蛋白在细胞凋亡中同时具有促凋亡及抗凋亡能力，例如 calpain 可以水解 p53 蛋白来保护细胞避免 DNA 损伤诱导的细胞凋亡 [14]，而 calpain 也可以通过裂解 p18 Bax蛋白以获得更有效的促凋亡活性 [15]。Capn4 作为 calpain1 和 calpain2 的调节亚基也具有抗凋亡及促凋亡的作用。研究表明在生长因子缺失、DNA 损伤、转录翻译抑制等条件下，capn4 发挥促凋亡作用，而在 TNF-α 及广谱激酶抑制剂十字孢碱（staurosporine，STS）诱导下，capn4 发挥抗凋亡作用，并且这种抗凋亡作用可能是通过 PI3-kinase/Akt 通路的激活来实现的 [16]。进一步研究发现，抑制 capn4 的活性，可导致蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）及叉头蛋白（forkhead transcription factors of the Oclass，FoxO）的磷酸化减少，可能与蛋白磷酸酶 2（protein phosphatase 2，PP2A）与 AKT 的紧密结合有关，故 capn4 的促凋亡作用可能通过 calpain-PP2A-AKT-FoxO 通路来实现 [17]。因此，capn4 对细胞凋亡发挥正向或负向调节作用可能是由不同的外界刺激所对应的信号通路的激活来决定的。

4　Capn4 与细胞周期

细胞周期是指细胞从一次分裂完成到下一次分裂结束的全过程。真核细胞的细胞周期与一系列的调控因子的结合与激活有关，主要有细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和 CDK 抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKI）。p27 Kip1 作为CDKI 的一种能广泛作用于各种细胞周期蛋白-CDK 复合物，发挥其抑制作用。在成骨细胞系中，capn4 的缺失可增加 p27 Kip1 蛋白的表达并减少其降解，有效抑制 cyclin D-cdk4 复合物的作用，减少成视网膜母细胞瘤蛋白（RB）的磷酸化，从而影响细胞从 G1 期向 S 期的过渡。而 p27 Kip1 的增加可能是由于 Akt/FoxO3A 通路的激活引起的 [18]。

5　Capn4 与肿瘤

根据 2012 年全球肿瘤流行病统计数据（GLOBOCAN 2012）显示，2012 年全球大约 1410 万新发癌症病例和820 万例死亡发生 [19]。癌症的研究已成为刻不容缓的问题。随着人类基因组计划的发展，从基因水平到蛋白质水平的研究已成为肿瘤研究的必然趋势。Calpain 家族与肿瘤的增殖、分化、侵袭转移等能力有着密切的关系，capn4 作为calpain 的调节亚基，对肿瘤的发生、发展同样存在着重要的意义。

5.1 Capn4 与肝癌

肝癌的高发病率与高死亡率一直是全球健康的巨大威胁，肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的类型，Bai 等 [20]发现相比于肝癌肝移植术后肿瘤未复发组，复发组患者肝癌细胞中 capn4 的 mRNA 水平及蛋白水平均过表达，并且在体外试验中抑制 capn4 的表达可降低肝癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力，体内试验中，干扰 capn4 的表达可明显抑制肿瘤的生长及肺部的转移。提示 capn4 对肝细胞癌的生长及侵袭转移起着重要的作用。乙肝病毒（HBV）的感染与 HCC 的发展有着密切的关系，是 HCC发病的重要病因之一，乙肝病毒 X 蛋白（HBX）是 HBV X基因编码的一种多功能蛋白，与原发性肝癌有着密切的联系，研究发现 HBX 可以通过增加 NF-κB 启动子的活性来增加细胞核中 NF-κB/p65 的表达及细胞质中磷酸化NF-κB/p65 的表达，而 NF-κB 可以直接与 capn4 启动子结合，激活 capn4 启动子的活性，增加 capn4 在基因水平及蛋白水平上的表达 [21]。后续研究发现 HBX 可以介导多种蛋白之间的相互交联作用，其中包括 NF-κB、5-脂氧合酶（5-LOX）、骨桥蛋白（OPN）和 capn4，并通过这些蛋白之间的相互作用来调节肝癌细胞的迁徙转移 [22]。在肝癌细胞中 capn4 的过表达可引起下游局部 FAK、SRC、p130Cas 磷酸化的增加，并增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达，从而促进肿瘤的进展和转移。capn4 与 P-FAK 的高表达预示着 HCC 的预后不良 [23]。不仅 HCC 与 capn4 相关，肝内胆管癌（ICC）中 capn4 也可以通过上调 MMP-2 的表达来影响肿瘤细胞的进展与转移，并且 capn4 的表达与 ICC 的淋巴转移、TNM 分期及预后存在密切联系 [24]。由此可见，虽然 capn4对肝癌的影响机制尚未完全明确，但是其为肝癌的治疗提供了新的理论依据，具有成为治疗新靶点的潜力。

5.2 Capn4 与乳腺癌

乙肝病毒 X 蛋白结合蛋白（hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）是一个分子量为 19 kD 的蛋白，研究表明 HBXIP 能促进乳腺癌细胞的增殖与迁徙 [25]。该机制可能是通过 HBXIP/MEKK2/ERK1/2/Capn4 信号通路来实现的 [26]。17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是女性发育及生理功能必不可少的一类激素，但其在病理条件下可刺激乳腺癌的发生与发展 [27]。E2 通过两种方式激活其生物活性，一种是基因组途径，即 E2 与细胞内的雌激素受体形成二聚体，该二聚体进入细胞核中诱导靶细胞的基因转入和蛋白质的合成，这种方式往往需要数小时或者更长时间；另一种途径为非基因组效应，即通过蛋白与蛋白之间的相互作用而不是直接的 DNA 结合，这种效应一般在数分钟内即可完成，如细胞内 Ca 2+的动员和细胞外信号调节激酶 1/2（ERKl/2）磷酸化的激活 [28-29]。Wang 等 [30]发现 E2 可快速诱导 ERK的磷酸化继而上调 capn4 的表达，而抑制钙激酶蛋白的活性可明显降低 E2 对 capn4 的诱导，这说明 E2 诱导的capn4 具有快速性和持续性。其机制可能是：① ERK 磷酸化激活后引起的 capn4 表达的快速上调可能发生在蛋白翻译水平，属于非基因组效应的核外作用的一部分；②当细胞质的 ERK 磷酸化后，其转移至细胞核内调节基因转录的激活，以此诱导后续 capn4 的改变。

5.3 Capn4 与其他肿瘤

在其他类型的肿瘤细胞中，capn4 也被发现异常活化。如在鼻咽癌中，与正常组织相比，capn4 在癌组织中高表达；并且 EB 病毒感染患者的肿瘤组织中 capn4 的表达比未感染的患者明显升高，提示 EB 病毒可能调控 capn4 的表达 [31]。在非小细胞肺癌中，癌组织中 capn4 高表达，并且与肿瘤的大小、淋巴转移相关，并且 capn4 可通过提高MMP-2 的表达来促进肿瘤的侵袭 [32]。

6　展望

虽然 capn4 对细胞的凋亡、细胞周期的影响及肿瘤生长转移能力的机制尚未完全阐明，但是 capn4为多种疾病的治疗提供了新的靶点。Capn4 可能是多种疾病进展的共同通路，尤其在肿瘤的发生发展中，一些与肿瘤高度相关的病因（如 EB、HBV）可能是通过影响 capn4 的表达，从而引起肿瘤的发生、发展、侵袭转移及复发等。Capn4 可能作为临床判断疾病及预后的标志，为以 capn4 及其信号转导通路为靶点的分子治疗提供了新的研究思路。