血管性认知障碍动物模型神经行为学评价工具研究进展

王志强综述，王庆松审校

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)自1993 年首次提出后，已经成为近20 y 来社会关注的焦点，也是神经科学领域研究的热点。VCI 的发病率呈逐年上升趋势，其发病率仅次于Alzheimer 病(Alzheimer disease，AD)，是引起老年期痴呆、导致老年生活质量下降的重要因素之一。虽然VCI 的临床研究取得了一定进展，但是VCI 的发病机制及病理生理变化仍然不明确，因此迫切的需要更多的基础研究为VCI 的预警诊治提供理论依据。

临床研究与基础研究最大的区别就是临床研究可以通过MMSE、Moca 等各类量表来直接反应患者的认知状况，而对动物认知障碍的认定只能通过各类评价工具来完成。但是，文献报道的认知评价工具及其应用各种各样，所以我们分析了近年来文献常用的评价方法及其应用，总结出目前常见的对实验动物认知功能的评价主要集中在参考记忆、工作记忆等。

1 参考记忆评价

空间记忆障碍是目前VCI 研究最多也最全面，空间记忆是指记忆中负责记录环境信息和空间方位的部分。

1.1 Morris 水迷宫 Morris 水迷宫(morris water maze，MWM)是利用动物求生本能促使其在水池内游泳找到逃生平台，参考记忆的评价通常包含定位航行、空间探索等阶段。MWM 是目前世界公认的较为客观的学习记忆功能评价方法［1］，主要是由于动物训练所需的时间较短，有利于急性期的认知评价;同时在迷宫内的线索，例如气味可以被消除掉;动物在实验中不需要禁食;MWM 较放射臂迷宫对学习记忆检测的灵敏度更高，在脑缺血后7 d 放射臂迷宫没有阳性发现时就能发现实验动物的参考记忆受损。由于国内外学者收集参数及排除标准不同，虽然作为经典的学习记忆评价工具近年来其实验结果的可信度引起国内外学者的质疑。例如:(1)不适合长期记忆功能的评价及重复实验，采用厌恶逃避测试本身就会产生应激，增加了混杂因素，增加假阳性风险;(2)非认知因素，如活动能力、听觉、嗅觉、触觉、焦虑抑郁等可能影响实验结果的可靠性［2］;(3)实验结果不能很好的反映组织病理结果［3］;(4)MWM 主要是反映海马依赖的视空间记忆功能，对于严重的缺血(全脑缺血模型)损伤皮质、丘脑等结构引起的认知缺陷无法反映。所以，Bingham 等在大量实验的基础上提出了排除标准以排除混杂因素干扰［2］。

1.2 Barnes 迷宫 Barnes 迷宫(barnes maze，BM)是基于动物运动功能受损时MWM 会增加假阳性率的需求而形成的。因为BM 对动物的体能消耗较少，理论上BM 是利用龋齿动物喜好阴暗环境的特点，通过平台外的空间定位信息作为线索，有效确定躲避场所的部位。与MWM 类似，实验过程通常包括学习训练实验和探索实验。BM 不需要食物剥夺和足底电击，因此对动物的应激较小;实验对于动物的体力要求很小，能最低限度的减少因年龄因素所致的体力下降对实验结果的影响;实验所需时间较少，根据各种实验方案的不同整个实验能在5～10 d［4，5］内完成。BM 在皮质下血管性痴呆引起参考记忆受损［5］、微栓子引起血管性痴呆［4］等模型中广泛使用。不仅能反映血管性认知障碍时海马CA1神经元的损伤与再生，而且还与内嗅皮质与齿状回之间突触连接数量的降低相关［6］。但是微栓子引起的认知功能障碍出现之前就已经存在焦虑抑郁等神经功能异常［4］，所以BM 评价空间学习记忆障碍的可靠性同样受到情感行为的影响。

1.3 放射臂迷宫实验 放射臂迷宫(radial arm maze，RAM)最早是由Olton 及其同事设计的，利用房间内提供的视觉参照信息，可以有效地确定放置食物的臂所在部位，目前最常用的是8 臂迷宫。参考记忆错误是指动物进入不曾放过食粒的臂。理论上RAM 是由食物奖励驱使的任务。其重复测量的稳定性较好。主要不足是开始实验前动物需要食物剥夺，动物及食物气味可能对实验结果产生干扰［7］。虽然实验动物的选择空间有限，但是目前认为RAM 仍然是一个测试参考记忆和工作记忆有效且灵敏的工具。RAM 已广泛用于慢性脑缺血(双侧颈总动脉阻断法［8］、四血管阻断法［9］)、颈总动脉狭窄模型［5］、危险因素［10］引起认知障碍的研究，为了排除视觉受损的干扰，在不同的臂内可以铺以不同质地的纸张来帮助实验动物导航［8］。

近年来应用的放射臂水迷宫(radial-arm water maze，RAWM)类似于MWM 和RAM 的结合，结合了MWM 和RAM的优点，因此敏感性更高能发现单侧颈总动脉阻断法引起的轻度认知障碍［7，10］。

1.4 主动/被动回避实验 根据所用仪器设备的不同又可分为明/暗箱回避［9］、穿梭回避、跳台回避等，回避实验主要反映皮质功能［11］。所以回避实验在技术上与暗示关联条件恐惧相类似。根据动物的逃避方式分为主动回避和被动回避(active/passive avoidance)。回避实验简单易行，观察指标多。但动物的反应差异性较大，要注意实验动物的筛选。由于主动回避的假阳性率较被动回避的假阴性率高，所以多采用被动回避实验。但是被动回避实验结果与组织病理结果相关性较差［12］。

主动位置回避(active place avoidance，APA)类似于主动回避，但是可以减少主动回避假阳性率。是指缓慢旋转的圆形平台上某一固定的象限设定为电击区域，平台在旋转但是电击区域不变，实验动物通过学习避免固定的电击区域，同样是利用实验动物对厌恶刺激(如足电击)的恐惧和记忆而建立起来的。较传统主动回避实验更复杂，因为实验动物需要忽略转盘上的嗅觉参照而通过视觉观察远处参照物来避免电击，主要通过电击次数评价学习记忆功能，运动总距离评价运动功能。Zhou 等通过对比发现，在大脑中动脉阻断的血管性认知障碍模型中APA 较被动回避的敏感性更高［12］。

1.5 金字塔任务 金字塔任务(ziggurat task，ZT)是利用空间参考信息让实验动物有效确定食物放置的金字塔所在位置，以此考验动物的记忆能力。实验开始之前实验动物必须经过1 w 的饮食限制。实验过程包含学习阶段(4 d)、记忆阶段和探索阶段。实验的过程由学习(第1、3、5、7 天)和记忆(第2、4、6、8 天)交替组成-在每个奇数天让大鼠寻找装有食物的新的目标金字塔，在每个偶数天目标位置不变，测试大鼠是否能寻找到先前的目标金字塔。第9 天是探索测试，在第一次测试食物放置在新的位置，实验动物需要探索学习以获得奖励，在第2 次和第3 次测试中不提供食物测试对前一次的记忆能力［13］。海马损伤大鼠在ZT 实验中学习记忆功能较对照组明显下降。因此该实验也是反映海马功能的有效的评价工具。金字塔任务较MWM 及RAM 等经典的评价工具有明显的优势:(1)最大的优点是能测试环境类似动物生活环境，对实验动物应激较小;(2)实验动物需要垂直及水平空间定位才能完成任务，不像MWM 及RAM 等经典的评价工具只能测试水平位置的空间定位能力;(3)由于该方法对实验动物体力消耗少、环境舒适等特点，所以该方法中实验动物的焦虑、抑郁等症状发生率较低;(4)同样可以通过不同计算方法同时评价工作记忆与参考记忆。

2 工作记忆评价实验

执行功能(executive function)是个体的许多认知加工过程的协同操作。它涉及对个体的意识和行为进行监督和控制的各种操作过程，包括自我调节、认知灵活性、反应抑制、计划等。而工作记忆(working memory，WM)是评价实验动物执行功能最常用的方法。工作记忆是指在执行认知任务过程中，用于信息的暂时储存与加工的过程［14］。工作记忆在人类及龋齿动物是依赖于前额叶皮质来完成的［14］。评价工作记忆的常用方法有如下几类。

2.1 自主交替实验 T、Y 迷宫自主交替(spontaneous altemation on a T/Y-maze)用来评价实验动物学习转换能力。即使没有食物奖赏，大鼠仍然保留对所探究区域有一定的新奇感。自发转换的次数/总选择次数用来说明工作记忆功能，VCI 动物比值得分下降。正常的交替操作与完整的工作记忆能力相一致。T 迷宫和Y 迷宫自主转换实验［15，16］已被广泛用于VCI 研究。而且，在双侧颈总动脉狭窄模型及双侧颈总动脉逐步阻断模型［17］中出现选择性的工作记忆受损。

2.2 MWM 工作记忆 是指Morris 水迷宫基础上改造的实验方法，通过每天改变逃生平台放置的位置，迫使实验动物找到新的逃生平台的位置［18］，也称作延迟匹配样本任务(delayed matched to sample task，DMST)。主要是通过为期4 d 的训练，训练方法与参考记忆的方法相同，只不过每天改变逃生平台的位置，迫使实验动物每天都学习新的逃生平台的位置。通过每天第一次训练时的逃离潜伏期和第四次测试阶段的逃离潜伏期对比来观察工作记忆能力［1，18，19］。

还有学者通过每天两次训练配对方法来完成工作记忆的测定。主要过程如下:实验包含12 d，每天训练两次，每天的第一次训练是为了信息获取，逃离平台放置在与前1 d 训练不同的位置;第2 次为记忆保持测试，逃离平台放置在与信息获取训练相同的位置。每3 d 为一组，每组两次训练之间间隔时间为30 s、30 min、2 h、6 h［20］。

也有学者通过对位训练(reveral phase)测定动物的工作记忆。主要过程如下:探查训练结束后，将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。对位探索训练是在最后一次对位训练的第2 天进行，方法与上述探查训练类似。但是也有学者认为对位训练属于参考记忆，只是能增加参考记忆的敏感性［21］。另外MWM 还可以进行延迟非样本匹配任务、辨别学习等不同版本［22］。

但是通过MWM 测定工作记忆耗时较长，经过参考记忆训练后应激会增加实验干扰因素，所以应用较放射臂迷宫少。

2.3 放射臂迷宫实验 实验动物利用房间内远侧线索所提供的信息，可以有效地确定放置食物的臂所在部位。实验方法与参考记忆评价方法相同，只是计算方法不同，工作记忆错误(working memory errors)是指在同一次训练中动物再次进入已经吃过食粒的臂，水迷宫不同，放射臂迷宫适合反复测试或长期记忆的测试，而且工作记忆与参考记忆可以同时完成。双侧颈总动脉狭窄引起认知障碍大鼠在30 d 和6 m 后工作记忆明显受损，与前额叶皮质下神经环路的损伤相关，这与临床皮质下缺血性血管性痴呆类似［5］。在放射臂迷宫中测试中，2-VO 大鼠在术后21 d 就出现工作记忆障碍，在此后6 m 内没有明显的进行性加重。双侧颈总动脉狭窄小鼠30 d 后在RAM 中出现选择性的工作记忆受损而参考记忆未见异常［23］。

2.4 金字塔任务 实验主要过程与ZT 空间记忆评价过程完全相同，实验参数评价方式与RAM 评价方式相同。该方法已在微栓子引起认知障碍中证明是可靠的评价方法［13］。ZT 与RAM 在评价工作记忆方面，不论从实验原理、实验过程及评价方式上都有许多相似之处。其最大优势主要在于测试空间参考记忆方面;而与MWM 相比，其主要是测试环境较为舒适，对实验动物刺激较小，因此能更精确的反映真是的认知状况。

2.5 洞板实验 洞板实验通常包含适应、训练和测试3个阶段。实验者可根据实验目的选择需要的实验阶段来进行［24］。由于普通洞板可能存在食物气味干扰，后来出现了改良洞板实验(modified hole board test，mHB)，在每个洞内固定食物做诱饵，其中数个(3 个)洞内另外放置能够取出并食用的食物。主要观察指标有选择错误次数，忽略次数，重复选择次数。动物进入没有食物洞的次数(选择错误)，或者没有进入提供食物洞的次数(忽略错误)可用来评价参考记忆;动物重复进入提供食物的洞(重复选择)用来评价工作记忆;初次进洞潜伏期，进洞次数，在板上停留时间/测试总时间，静止时间/总时间焦虑抑郁等。较MWM 测试，mBH 动物饲养及测试环境没有应激因素，避免混杂因素的干扰;较RAM没有食物剥夺，而是提供对实验动物高度诱惑的食物奖励，从而使动物能很好的配合实验;其次，mBH 能同时测试运动、认知及行为参数，便于控制组间配合，实验结果可信度更高。改良洞板测试在VCI 研究中的应用较少［25］。可能是由于该实验耗时较长，适应、训练阶段就需要14 d 来完成［24］，不适于短期实验的应用。

2.6 物体辨别实验 物体识别实验(object recognition test，ORT)是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法。该方法具有让实验动物在自由活动状态下进行学习记忆测试的特点，能更近似地模拟人类的学习记忆行为。根据测试间隔时间可评价短期记忆(15 min)和长期记忆(24 h)。实验动物对环境中两个相同物体的熟悉期，记录大鼠与这两个物体接触的情况。然后将熟悉物体的其中一个换做新物体，主要观察大鼠对新物体的探究情况。在ORT 中分别记录实验期探索熟悉物体(TF)和探索新物体(TN)的时间。实验期对新物体的识别指数(recognition indices，RI)被定义成TN/(TF+TN)×100%、辨别指数(discrimination indices，DI)TN -TN/(TF+TN)×100%［19，21］。这种方法可以说是一种单纯的工作记忆测试，完全不同于参考记忆;而且与灵长类工作记忆相似能够相互比较;完全依赖于动物天性来测试不需要强化，所以得到广泛应用。

虽然执行功能在人类认知功能中占有很重要的地位，因而研究非常广泛，但是在动物实验中却很少研究，或者很少将执行功能缺陷单独进行讨论。执行功能主要依赖于前额叶皮质结构、功能的完整性，但是在脑血管病动物模型中其他脑区(海马、纹状体等)也受到影响，所以单独说明前额叶皮质与执行功能之间的直接关系存在一定难度。

3 总结与展望

目前对于学习记忆的研究进展十分迅速，各种学习记忆的理论不断涌现。按照这些理论而设计的动物模型及认知功能评价工具也不断出现。而各种先进实验技术及影像学技术，如神经电生理技术的LTP、ERP 和脑成像技术的功能核磁共振成像都被应用于学习记忆的研究中，给学习记忆的研究开辟了一条新的途径。因此，如何对传统的行为学评价方法进行统一规范，制定标准的评价流程，不仅有利于不同实验之间的比较，更有利于把传统的行为学研究方法和最新的研究技术相结合，为学习记忆的研究提供更广阔的思路。

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