MMP-9 在单纯疱疹病毒性脑炎中的表达及对血脑屏障的影响

周 瑜，曾艳平，周 琴，关景霞，卢祖能

单纯疱疹病毒性脑炎(herpes simplex encephalitis，HSE)是临床上常见的中枢神经系统感染疾病，导致脑组织出血坏死性损害，神经功能障碍较严重，但其具体的病理机制尚不明确。研究发现，小胶质细胞激活介导的继发性免疫损伤在其中起着关键的作用［1，2］。在脑损伤的各种病理因素中，基质金属蛋白酶(MMPs)的作用受到广泛关注，MMPs，尤其是MMP-9 可以促进脑组织毛细血管破坏，导致脑组织继发性脑水肿和脑出血［3，4］。MMP-9 在HSE 发病机制中的作用尚不清楚，本实验探讨HSE 中MMP-9 的表达及其对血脑屏障的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3 周龄Balb/c 雄性小鼠95只，体重11～13 g，购自湖北省实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 HSV-1 病毒和Vero 细胞由华中科技大学武汉协和医院中心实验室病毒室惠赠，H-DMEM 培养基、新生牛血清购自Gibco 公司，胰酶(Trypsin)购自美国AMRESCO 公司，抗体均购自美国eBioscience 公司，BB-94 购自British Biotech Pharmaceuticals 公司，明胶(gelatin)购自美国Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 超净工作台(苏州净化设备厂)，台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，CO2恒温细胞培养箱(美国Napco 5410-220)，低温离心机(美国Beckman 公司)，微量加样器(美国基尔森公司)，低温冰柜(日本MDF-382E)，恒温水浴箱(重庆万达有限公司)，解剖剪、镊(上海医疗仪器厂)，血细胞计数板(西安化学试剂厂)，相差显微镜(日本Olympus)，激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluoview FV500 Imaging System)，6、24 孔培养板(美国Gibco 公司)，一次性细胞培养瓶(美国Corning-Costar 公司)。

1.2 方法

1.2.1 病毒的滴定 HSV-1 病毒通过Vero 细胞中培养增殖后收集上清液，用维持液［含5%(体积分数)新生牛血清的DMEM 培养基］10 倍系列稀释，Vero 细胞于96 孔板中长成单层细胞，接种系列稀释的病毒液，对照孔和感染病毒孔均加入100 μl维持液。37 ℃、5%(体积分数)CO2细胞培养箱孵育。每天观察并记录出现细胞病变(细胞折光性增强、细胞变大变圆或融合性病变)的孔数。细胞病变不再发展时，经Reed-Muench 法计算TCID50 病毒滴度为10～5/20 μl，选择100 倍TCID50 病毒滴度10～3/20 μl 接种小鼠。

1.2.2 实验分组 实验小鼠20 只分为对照组和病毒组各10 只，观察14 d 内小鼠的发病情况及存活率，留取脑组织行病理切片。30 只随机分为对照组和病毒组，每组15 只，用于明胶酶谱及免疫荧光共聚焦检测。另取45 只小鼠分为对照组、病毒组、BB-94 处理组各15 只，用于脑组织水含量及血脑屏障通透性分析。

1.2.3 动物模型 按体质量3.5 ml/kg 予小鼠10%(体积分数)水合氯醛腹腔注射麻醉后，从右侧眼外眦与外耳道口连线中点处进针2～3 mm，向颅内注入HSV-1 制造HSE 模型。对照组注入细胞培养上清液20 μl，病毒组注入病毒液20 μl，BB-94处理组在注入病毒液20 μl 后12 h 给予BB-94(30 mg/kg)腹腔注射。

1.2.4 脑组织MMP-9 及MMP-2 明胶酶谱检测 分别于感染后第3 天、第7 天，每组小鼠取3 只深度麻醉后断头，取脑组织约0.2 g 在1 ml 冷匀浆缓冲液中匀浆，超声20 s 后，4 ℃12 000 ×g，离心15 min，收集上清，考马斯亮蓝法测定各样品中蛋白含量，随后上样于含1 mg/ml 明胶的10% SDSPAGE，电泳。电泳后，凝胶在50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7.6，2.5% Triton X-100，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2)中漂洗两次，每次45 min;之后在50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7.6，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2)中再漂洗两次，每次30 min;在孵育液［50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2，0.02% Brij-35］中于37 ℃孵育42 h，使上样液电泳后条带中的金属蛋白酶充分降解凝胶中的明胶底物，之后凝胶经考马斯亮兰R-250 染色3 h，然后脱色，即可见在相应质量金属蛋白酶所在条带明胶降解处，为白色透明条带，而其余凝胶背景为蓝色。利用激光扫描光密度分析法半定量分析扫描条带。

1.2.5 脑组织MMP-9 免疫荧光共聚焦检测感染后第3 天，取3 只病毒组小鼠深度麻醉后断头，取右侧大脑半球行冰冻切片，3% BSA(用TBS 稀释)于室温下封闭1 h;倾去封闭液，按1∶ 100 稀释比加入一抗200 μl (兔抗OX-42 IgG，一抗稀释液为含3% BSA 的TBS，pH 7.2，含0.02% NaN3)，37 ℃孵育60 min，PBS(含0.3% TritonX-100)冲洗5 min×3;滴加荧光素标记的二抗(1%BSA-PBS 1∶ 100稀释)200 μl，37 ℃孵育45 min，PBS 冲洗5 min×3;滴加三抗200 μl(羊抗MMP-9 IgG，稀释比为1 ∶100)和荧光素标记的四抗200 μl(1% BSA-PBS 1∶100 稀释)并重复上述孵育及PBS 冲洗步骤。异硫氰酸荧光素(FITC，显绿色荧光)标记OX-42，Cy3 荧光素(显红色荧光)标记MMP-9。甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.6 脑组织含水量检测 病毒感染后第3天、第7 天，将各组小鼠各3 只深度麻醉后断头，取右侧大脑半球，精密电子天平称湿重(wwt);置80 ℃烤箱中，连续烘烤48 h 至恒重(最后两次质量差≤0.2 mg)后称干重(dw)。按Elliott 公式计算脑组织含水量(%)。脑组织含水量(%)=(wwt -dw)/wwt×100%。

1.2.7 脑组织血脑屏障通透性的测定 各组鼠3 只在相应时间点麻醉后，经尾静脉注入4% EB(160 mg/kg)，观察小鼠眼球结膜、四肢，于注射后几秒钟变蓝，表明注入成功。2 h 后开胸通过左心室灌注生理盐水，直至右心房流出无色液体。断头取右侧大脑半球，称重后加入2 ml 甲酰胺，54 ℃恒温水浴箱中，孵育24 h。将溶有EB 的甲酰胺溶液过滤，用分光光度计(λ=610 nm)检测光密度值。根据EB 标准曲线计算脑组织EB 含量(ng/mg)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，采用One-Way ANOVA 法进行检验。数据均以均数± 标准差(χ ± s)表示，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠生存状况 各组小鼠在HSV-1 感染后14 d 内作生存率观察，对照组至第14 天结束时均存活，病毒组小鼠于病毒感染后第3 天开始发病，表现为消瘦、耸毛、蜷缩、肢体麻痹、低反应性、衰竭和死亡。感染后第5～6 天症状达高峰，并多于2 d内死亡，14 d 结束时病死率为100%。

2.2 HSV-1 感染后脑组织MMP-9、MMP-2 表达活性 明胶酶谱实验显示，在相对分子质量标准92 kb、72 kb 处均出现明显的透明酶解带，分别为MMP-9、MMP-2 对应条带。对条带进行扫描分析(条带吸收峰值)，结果以对照组脑组织明胶酶活性水平标准化，分析数据显示，HSV-1 病毒感染后3 d和7 d，脑组织中有较高MMP-9 活性水平，分别为对照组的1.98 ±0.22、2.18 ±0.16 倍。而脑组织中MMP-2 活性水平在病毒感染后无显著改变(见图1A、1B)。

2.3 免疫荧光观察脑组织MMP-9 表达 免疫荧光共聚焦显示，MMP-9 主要在OX-42 阳性细胞中表达，表明单纯疱疹病毒性脑炎中激活的小胶质细胞是MMP-9 的主要来源(见图2)。

2.4 病毒感染后脑组织水含量及血脑屏障通透性的变化 HSV-1 感染后破坏血脑屏障，与对照组比较，脑组织水含量与血脑屏障通透性在感染后第3 天和第7 天均显著增加(P ＜0.05)，MMP-9 抑制剂BB-94 处理组可见血脑屏障通透性较病毒组降低，脑组织水含量亦下降(见表1)。

表1 脑组织血脑屏障通透性及水含量的变化(，n=3)

表1 脑组织血脑屏障通透性及水含量的变化(，n=3)

注:与对照组比较* P ＜0.05;与病毒组比较#P ＜0.05

图1 HSV-1 感染后脑组织MMP-9、MMP-2 表达活性与对照组比较* P ＜0.01

3 讨论

HSV-1 所致单纯疱疹病毒性脑炎目前病死率仍高达20%，半数以上的患者常遗留严重的神经功能缺损［5］。研究发现，HSV-1 主要从两个方面造成神经损害:(1)病毒复制增殖直接造成神经细胞和神经胶质细胞的损害;(2)病毒激活了颅内的免疫炎症过程，并不断扩大，引起脑组织的免疫病理损伤，包括脑水肿、颅内压增高和出血坏死。HSE 患者长期存在免疫激活反应，与患者不良的预后和严重后遗症相关［6］，即使早期给予抗病毒治疗，预后仍不佳。因此，较之病毒的直接损害作用，病毒感染后继发的炎性反应在病理过程中可能起着关键作用。

单纯疱疹病毒性脑炎后血脑屏障破坏导致脑炎后脑水肿、颅内高压及相关并发症的产生，直接影响到患者的生存率和神经功能的恢复。基质金属蛋白酶(MMPs)破坏血脑屏障、影响神经血管单位的完整性，在促进炎性损害过程中起着重要的作用［7，8］。神经血管基质的破坏，外周炎性细胞侵入中枢神经系统，可进一步触发脑血管并发症，加重继发性病理损伤［9］。Ⅳ型胶原、层粘连蛋白以及纤维结合素是血管细胞外基质骨架的主要组成部分，基质金属蛋白酶中明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)是破坏血脑屏障的主要成分，在病毒性脑膜炎患者脑脊液及血清中MMP-9 水平均增加［10，11］。但MMPs 在单纯疱疹病毒性脑炎病理损伤中的作用尚不明确。

本研究发现，在病毒感染后第3 天，即单纯疱疹病毒性脑炎早期，MMP-9 表达明显增高，到第7 天时活性水平更高，相应的血脑屏障的通透性增高，脑组织水含量增加，脑水肿加重。但MMP-2 的表达在病毒感染后第3 天、第7 天并未见明显改变。表明单纯疱疹病毒性脑炎中，MMP-9 而非MMP-2 在其病理机制中发挥重要作用。进一步我们观察到使用MMP-9 抑制剂BB-94 组小鼠脑组织EB 含量及水含量均较病毒组明显降低，说明BB-94 可以保护血脑屏障的通透性，从而减轻脑水肿。

图2 脑组织MMP-9、OX-42 免疫荧光共聚焦

小胶质细胞作为存在于脑中的单核细胞，被认为具有抗原提呈、分泌细胞因子及吞噬作用，在多种病毒性脑炎中的作用受到日益关注［12］。小胶质细胞激活在病毒性脑炎中具有双重作用(抗病毒或免疫损伤)，在HSE 中病毒可促发小胶质细胞产生一系列强有力的免疫炎性反应，但并不能保护小鼠的发病与死亡［13］。HSV-1 可通过Toll 样受体2(Tolllike receptor 2，TLR-2)诱发颅内的炎性反应，TLR-2基因敲除小鼠病毒感染后炎症因子表达减少，并显著提高了小鼠的存活率［14］。本实验中我们发现MMP-9 主要在OX-42 阳性细胞中表达，表明激活的小胶质细胞是MMP-9 的主要来源。我们推测病毒感染后激活脑内小胶质细胞，表达MMP-9 及系列炎性因子，破坏脑实质的神经血管基质结构，形成典型的出血坏死性病理改变。

通过本实验的初步研究表明，小胶质细胞激活表达的MMP-9 在单纯疱疹病毒性脑炎发病机制中起着重要作用，通过抑制MMP-9 的表达有可能为治疗单纯疱疹病毒性脑炎提供新的治疗策略。

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