甲泼尼龙冲击治疗对缓解复发型多发性硬化早期血清中IL-23和IL-17A水平的影响

梁军利 赵丽君 钱琪 吕海东 袁利 马晓丽

甲泼尼龙冲击治疗对缓解复发型多发性硬化早期血清中IL-23和IL-17A水平的影响

梁军利 赵丽君 钱琪 吕海东 袁利 马晓丽

目的 探讨甲泼尼龙(MP)冲击治疗对复发缓解型多发性硬化(RRMS)患者血清中IL-23和IL-17A水平的影响。方法 选择24例RRMS患者(RRMS组)及20例神经系统非炎性疾病患者(NIDNS组)，采用ELISA方法检测MP冲击治疗(1.0 g 静脉滴注 1次/d×3,之后0.5 g 静脉滴注 1次/d×4)前后血清中IL-23、IL-17A的水平并计算阳性检出率〔以治疗前后450 nm处D(λ)值均为阴性对照D(λ)值的2.1倍以上者为阳性，阳性检出率=阳性例数/总例数×100%〕。结果 RRMS组IL-23和IL-17A阳性检出率明显高于NIDNS组(IL-23：79.17%vs. 35.00%，χ2=7.071，P=0.008；IL-17A：83.33%vs. 30.00%，χ2=10.725，P=0.001)；RRMS组治疗后血清中IL-23、IL-17A水平〔分别(382.4±124.7) pg/mL；(32.8±20.2) pg/mL〕较治疗前〔分别(610.6±102.5) pg/mL；(74.6±21.7) pg/mL〕明显下降(IL-23:t=14.672,P=0.000；IL-17A：t=11.108,P=0.000)，但仍高于NIDNS组〔IL-23: (88.7±8.4) pg/mL，t=10.344，P=0.000；IL-17A：(18.1±0.9) pg/mL，t=9.205，P=0.000〕。结论 IL-23和IL-17A可能与MS发病有关，MP冲击治疗可降低RRMS患者血清中IL-23和IL-17A水平。

多发性硬化；甲泼尼龙；细胞因子

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统脱髓鞘疾病，其发病机制仍不明确，目前研究认为与细胞因子失衡有关。目前已发现，一种以分泌IL-17为特征的Th17细胞与自身免疫反应有关，IL-23通过促进CD4+T细胞分泌炎性细胞因子IL-17A发挥其促炎效应，并提出了IL-23/IL-17轴发病机制学说[1]。目前，对IL-23、IL-17A在复发缓解型多发性硬化(relapsing remitting multiple sclerosis，RRMS)发病机制中的作用，以及糖皮质激素(激素)治疗对IL-23、IL-17A影响的研究，尚不完全清楚。本文通过检测RRMS患者甲泼尼龙(MP)冲击治疗前后血清中IL-23和IL-17A水平，旨在探讨IL-23、IL-17A在MS发病中的作用，以及激素治疗对IL-23、IL-17A的影响。

1 对象和方法

1.1 观察对象 选择2010-06-2013-06在焦作市人民医院和解放军第91医院神经内科住院的RRMS患者(RRMS组)24例，男8例、女16例；16～48岁，平均年龄(34.5±7.2)岁。入组标准：根据2005年McDonald诊断标准[1]确诊为RRMS的患者，发病72 h内入院，神经功能障碍量表(EDSS评分)1.5～8分，激素治疗后症状明显减轻，EDSS评分减少>1分。排除标准：入院前3个月内接受免疫调节治疗(包括接受激素、环磷酰胺等免疫抑制剂、干扰素制剂、考帕松和那他珠单抗等治疗)患者；合并其他免疫相关疾病，如系统性红斑狼疮、糖尿病、肿瘤等患者；合并颅内外感染，如脑炎、脑膜炎等患者；脑卒中患者。

神经系统非炎性疾病(non inflammatory diseases of nervous system，NIDNS)患者20例作为对照组，其中男9例、女11例，年龄14～51岁，平均(35.2±9.5)岁，包括紧张性头痛患者5例，周期性瘫痪患者15例，患者头颅CT或MRI未见异常，脑脊液常规、生化、细胞学、寡克隆区带、24小时免疫球蛋白G合成率检查结果均正常。排除标准：(1)并发严重心、肝、肾功能不全；(2)脑出血、脑梗死及其他脑部合并症；(3)急、慢性感染；(4)合并其他自身免疫性疾病；(5)肿瘤；(6)合并妊娠；(7)应用非甾体类抗炎药物者，或6个月内接受免疫抑制剂、激素或其他免疫治疗。

两组患者均签署知情同意书。两组之间性别和年龄的比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法 所有NIDNS组和RRMS组患者，均于入院第二天上午采肘静脉血5 mL，立即经4000 r/min离心(离心半径350 mm)5 min，取上清液分装于分离管内，标记，-80℃冻存待测。RRMS组患者给予MP(1.0 g 静脉滴注 1次/d×3,之后0.5 g 静脉滴注 1次/d×4)治疗，同时加用护胃药物、补钙补钾治疗，共治疗7 d后再次采肘静脉血5 mL，同样方法保存待测。

采用免疫酶联双抗体夹心ELISA法检测NIDNS组及治疗前后RRMS组血清中IL-23、IL-17A的水平，人IL-23和IL-17A ELISA试剂盒购自美国(R&D systems)。采用WE scanmk-2全自动酶免仪(芬兰生产)，微量加样器。严格按照说明书操作。IL-23的灵敏度10 pg/mL，IL-17A的灵敏度2 pg/mL，板内、板间变异系数均小于5%。按照说明书，治疗前后检测时均设置复孔(同一样品加到2个孔中，取平均值)。在ELISA检测仪上，于450 nm处以空白对照孔调零后测各孔D(λ)值，若治疗前后两次检验结果均大于规定的阴性对照D(λ)值的2.1倍，即为阳性。阳性检出率=阳性例数/总例数×100%。所有NIDNS组和治疗前后RRMS组患者血清中IL-23和IL-17A水平(包括检出率为阳性和阴性患者，计算复孔平均数为各样本水平)。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析。计量资料(NIDNS组和治疗前后的RRMS组血清中IL-23和IL-17A水平)以均数±标准差表示，阳性检出率以百分率表示，RRMS组治疗前后血清中IL-23和IL-17A水平的比较采用配对t检验，RRMS组治疗后与NNID组血清中IL-23和IL-17A水平的比较采用两独立样本的t检验，阳性检出率的比较使用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者IL-23和IL-17A阳性检出率比较 RRMS组患者IL-23阳性检出率〔79.17%(19例)〕、IL-17A阳性检出率〔83.33%(20例)〕明显高于NIDNS组〔35.00%(7例)，χ2=7.071，P=0.008；30.00%(6例)，χ2=10.725，P=0.001)〕。

2.2 两组IL-23和IL-17A水平比较 RRMS组治疗后血清中IL-23、IL-17A水平〔分别(382.4±124.7)pg/mL；(32.8±20.2)pg/mL〕较治疗前〔(610.6±102.5)pg/mL；(74.6±21.7)pg/mL〕明显下降(IL-23:t=14.672，P=0.000；IL-17A：t=11.108，P=0.000)，但仍高于NIDNS组〔(88.7±8.4)pg/mL；(18.1±0.9)pg/mL〕(IL-23:t=10.344，P=0.000；IL-17A：t=9.205，P=0.000)。

3 讨论

MS是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，其病因和发病机制复杂。既往研究发现，MS是Thl细胞介导的自身免疫性疾病，与Thl/Th2平衡失调相关，提出了细胞因子IL-12/γ-干扰素(IFN-γ)轴发病机制学说。Cua等[2]通过对MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)研究发现，IL-23在EAE的发病过程中起着比IL-12更为关键的作用。IL-23和IL-12都是P40家族成员之一，结构非常相似，IL-12由P40和P35两个亚单位组成，而IL-23由P40和P19两个亚单位组成。对敲除P40基因的小鼠诱发EAE不敏感，而对敲除P35基因(即IL-12)的小鼠诱发EAE却高度敏感，故认为IL-23是介导EAE的关键细胞因子[3]，因而推测IL-23/IL-17轴在MS发病机制中发挥重要作用[3]。

本研究采用ELISA方法检测发现RRMS急性期血清中IL-23水平明显高于NIDNS组，这和Chen等[5]的研究结果相一致。而Li等[4]发现MS患者IL-23在急性和慢性活动病灶中高表达，正常人脑组织中却低表达甚至难以检测到。本研究还发现，NIDNS组患者血清中IL-23的阳性检出率极低，而RRMS组患者有很高的阳性检出率，这也间接印证了Li等[4]的观点。由于炎性反应与脱髓鞘病灶均与IL-23高表达相联系，上述研究提示IL-23对于募集和激活诱导慢性炎性反应的炎性细胞具有重要作用，并可能在MS发病机制中占据重要地位。

IL-23能够调节Thl7细胞的稳态、扩增，是Thl7细胞存在的必需细胞因子[6]。Thl7细胞能够分泌IL-17A、17F。IL-17A是主要由Th17细胞产生的具有广泛生物学活性的早期炎性细胞因子[7]，可刺激成纤维细胞、内皮细胞分泌如IL-6、IL-8、前列腺素E2、单核细胞化学趋化蛋白-1和粒细胞集落刺激因子等各种细胞因子，还可促进补体C3等急性期反应蛋白的产生，诱导炎性反应[8]。

本研究发现，RRMS组患者IL-17A水平及阳性检出率也明显高于NIDNS组，提示IL-17A可能与MS的发病密切相关，这和Chen等[5]、Muls等[9]的研究结果相一致。Steinman等[10]在人类MS损伤组织中发现了IL-17A表达；Li等[11]也发现，MS患者中记忆性Thl7细胞比例升高，且其升高程度与临床症状严重程度相关，体外培养MS患者分离出的CD4+T细胞产生更多的IL-17。通过对IL-17受体缺乏和/或基因敲除IL-17小鼠在体和离体研究发现，IL-17受体缺乏和/或基因敲除IL-17小鼠与正常小鼠相比，前者EAE发生减少，发病的严重程度也减轻[12]。Golzari等[13]发现通过减少外周血单核细胞和血浆IL-17水平，可减轻炎性反应程度，减少女性MS患者的致残率，改善预后。这些研究均提示阻断IL-17通路，有可能成为治疗MS的新途径。

根据我国国情，干扰素制剂治疗目前仍难以推广，大剂量激素治疗不良反应较多，且预防复发疗效不确切，寻找有效替代药物尤为重要。MP对治疗急性期MS有效[14]，但预防其复发疗效不确切，其作用机制尚不十分清楚。为了解MP对RRMS细胞免疫功能的影响，本研究中检测了MP冲击治疗后RRMS患者血清中IL-23、IL-17A水平，发现治疗后较治疗前明显减低，但仍高于对照组，提示MP可通过抑制IL-23/IL-17轴发挥抗炎作用。这可能是因为MP能够抑制树突状细胞提呈抗原和共刺激信号，降低细胞间黏附因子和血管间黏附因子产生，从而抑制了Th17细胞激活及其通过血-脑脊液屏障的能力。虽然MS患者MP冲击治疗后临床症状明显减轻，但血清中IL-23、IL-17A水平仍高于对照组，是否适量延长激素治疗时间至IL-23、IL-17A水平正常以预防MS复发，仍需进一步研究。

综上可见，MP作为RRMS急性期治疗用药能够明显降低RRMS患者IL-23和IL-17A水平。IL-23和IL-17A是新近被认识到的在MS发病机制中发挥重要作用的两种细胞因子，是否通过抑制IL-23/IL-17轴治疗及预防MS，仍需进一步的临床研究。

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(本文编辑：邹晨双)

Effect of methylprednisolone on the serum leves of IL-23 and IL-17A among patients with relapsing remitting multiple sclerosis

LIANGJunli*,ZHAOLijun,QIANQi,LVHaidong,YUANLi,MAXiaoli.

*DepartmentofNeurology,JiaozuoPeopleHospital，JiaozuoHenan454000，China

LIANG Jun-li, Email：godloveliangjunli@126.com.

Objective To investigate the serum levels of IL-23 and IL-17A in relapsing remitting multiple sclerosis (RRMS) patients after methylprednisolone pulse therapy . Methods ELISA method was used to detect the levels of IL-23 and IL-17A and the positive rate (450 nm D value 2.1 times more than the negative control D value both before and after treatment was defined as positive, the positive rate=positive cases/total number of cases multiplied by 100%)in 24 cases of RRMS patients before and after corticosteroid therapy(1.0 g，intravenous drip per day for three days and 0.5 g intravenous drip per day in the next 4 days) and 20 cases with non-inflammatory diseases of nervous system (NIDNS) patients. Results The detection rate of IL-23 and IL-17A in the RRMS group was significantly higher than the NIDNS group (IL-23:79.17%vs. 35.00%, χ2=7.071,P=0.008; IL-17A:83.33%vs. 30.00%, χ2=10.725,P=0.001); The levels of IL-23 and IL-17A descended in serum of RRMS patients after methylprednisolone pulse therapy [IL-23: (382.4±124.7) pg/mLvs. (610.6±102.5) pg/mL,t=14.672,P=0.000；IL-17A：(32.8±20.2) pg/mLvs. (74.6±21.7) pg/mL,t=11.108,P=0.000],but were still much higher than those in the NIDNS group [IL-23: (88.7±8.4) pg/mL,t=10.344,P=0.000；IL-17A：(18.1±0.9) pg/mL,t=9.205,P=0.000]. Conclusions IL-23 and IL-17A are associated with the pathogenesis of MS. Methylprednisolone pulse therapy can reduce the levels of IL-23 and IL-17A in sera of RRMS patients.

multiple sclerosis; methylprednisolone;cytokines

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.02.005

454000 焦作市人民医院神经内科(梁军利、钱琪、吕海东、袁利、马晓丽)； 454000 中国人民解放军91医院神经内科(赵丽君)

梁军利，Email：godloveliangjunli@126.com

R744.5+1

A

1006-2963 (2015)02-0093-04

2014-09-03)