RNA干扰在生物基因治疗中的应用及意义

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(1.南华大学,湖南 衡阳 421001；2.海南省人民医院消化内科)

·文献综述·

RNA干扰在生物基因治疗中的应用及意义

肖倩1,2,孙晓宁2*

(1.南华大学,湖南 衡阳 421001；2.海南省人民医院消化内科)

RNA干扰(RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱导的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段，在生物医学领域有着广阔的应用前景。本文拟就RNAi作用机制，及其在功能基因组学、基因治疗(如肿瘤、病毒、自身免疫性疾病等)领域的研究现状简要作一综述。

RNA干扰； 基因沉默； 功能基因组学； 基因治疗

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指双链RNA(double strands RNA，dsRNA)与细胞内的同源序列mRNA相结合并使其降解的现象，从而特异抑制相应基因表达的调控系统,是生物进化过程中发展起来的自我保护机制。RNAi现象广泛存在于各种生物中，如果蝇、水稻、小鼠及人类等，属于RNA水平上调节基因表达的方式，对生物的生长发育起着非常重要的作用。自发现以来，RNAi的研究取得了巨大的进展，被广泛用于探索基因表达调控、基因治疗及药物开发等领域。

1 RNAi的发现

RNA干扰现象最早应追溯到1990年矮牵牛花颜色基因的共抑制现象。1995年，Guo等[1]用反义RNA技术阻断线虫par-1基因的表达时，发现正义RNA具有与反义RNA同样可以抑制该基因表达的作用。这一现象直到1998年才有了新的解释，Fire等[2]推断之前提到的ssRNA(single strand RNA,单链RNA)导致par-1基因沉默是因为制备单链时混有微量的dsRNA所致，发现这种抑制现象在原核生物中具有可遗传性，将这种现象命名为RNA干扰(RNA interference),简称RNAi。2001年Elbashir等[3]率先在哺乳动物细胞中观测到了RNAi现象,从而开启了RNAi技术在哺乳动物细胞中应用研究的闸门。2002年研究发现RNAi能在哺乳动物细胞内高效沉默目标基因的表达后，RNAi技术开始应用在生命科学的各个领域。目前，实验中常用的RNAi手段主要包括直接转染小或短干扰RNA(sm1all/short interfering RNA，siRNA)以及转染携带小或短发卡RNA(small/short hairpin RNA，shRNA)的质粒。

2 RNAi的作用机制

RNAi的作用机制目前还不十分清楚。目前初步阐明RNAi发生的机制大致可分成3个阶段：(1)启动阶段:外源性基因如病毒基因、人工转入基因等随机整合到宿主细胞组内并进行转录,产生的dsRNA被一双链RNA酶III型(Dicer酶)剪切成21～23nt的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)。另外，siRNA的5′端磷酸化，3′端为羟基末端且有两个不配对核苷酸，此结构形式可能是siRNA进入RNA干扰的通行证[4-5]。(2)效应阶段:siRNA与细胞内的特异蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，但激活RISC得需要一个ATP依赖的siRNA解双链的过程[5]。之后正义链RNA被置换出来，而反义链RNA仍结合在复合物上，从而形成具有生物活性的复合物。具有活性的RISC作用于与其上的单链siRNA序列互补的mRNA，由核酸内切酶在距离siRNA 3′端12个碱基的位置将mRNA剪切成21～23 nt的片段,从而特异性地抑制了靶基因的表达[6]。(3)级联放大阶段:RISC与靶mRNA结合后以siRNA反义链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下，将单链mRNA转变为双链。后者再由Dicer酶切割产生新的大量siRNA,使得RNAi的作用进一步放大,最终把靶mRNA完全降解,从而显著增强了对相关基因表达的抑制作用[6-8]。

3 RNAi的应用及意义

3.1 RNAi与功能基因组学

人类已经进入后基因组时代，基因组学的重心已由结构基因组学转向功能基因组学，RNAi技术以其高度特异性、高效、操作简单及周期短等特点，也就义不容辞的成为研究基因功能的强大工具。将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA形成dsRNA产生RNA干涉，使得目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能[9]，使目的基因按照人们的意图去表达。所以，RNAi能够在后基因组时代里发挥其不一般的作用。

3.2 RNAi在基因治疗中的应用

RNAi作用的这种高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，且又不影响正常的等位基因[9]，所以RNAi在治疗疾病方面较传统治疗方法更有效而副作用更小。

3.2.1 RNAi与肿瘤 肿瘤是由多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，如果只针对单个突变基因进行的肿瘤基因治疗，效果并不理想。而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性设计，针对这一序列的dsRNA分子只需导入一种dsRNA就可以使多个基因同时沉默多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA。目前RNAi对肿瘤进行基因治疗主要集中在与肿瘤发生和肿瘤转移相关基因(如癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因)以及与肿瘤耐药基因、细胞凋亡、信号传导、有丝分裂及肿瘤血管生长等一系列有关的基因方面。如Zhang等[10]以人的肝细胞癌细胞系SMMC7721为模型检测到信号传导蛋白和转录激活物5(signal transducer and activator of transcription 5,Stat5)(Stat5在人的多种肿瘤中被发现高表达)在细胞系中高表达，发现用RNAi介导的Stat5基因沉默可以抑制肿瘤细胞生长，甚至诱导细胞凋亡。Qiu等[11]利用慢病毒包装针对血管内皮生长因子(VEGFA)基因的RNAi载体，导入结直肠癌细胞后发现VEGFA表达被抑制后，结果有效的抑制了肿瘤细胞的生长、迁移及增殖。以上研究说明RNAi的发现为肿瘤的基因治疗带来了希望之光。

3.2.2 RNAi与病毒 RNAi是机体的一种由小分子RNA介导的序列特异性免疫保护性机制。RNAi能够通过直接靶向病毒的mRNA从而导致病毒主要蛋白的降解[12-13]。RNAi技术已经广泛应用于病毒基因的转录后调节并且已经成功抑制了多种病毒的复制。RNAi治疗最关键的一点是寻找合适的靶点。到目前为止，几乎所有的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)编码和调控基因已经被用作抗HIV RNAi治疗的靶点并在体外实验中得以验证。其中效果比较好的有tat、rev基因等[14]。来自宿主的RNAi靶点，目前已经通过实验证明有效的包括NF-κB、CD4、趋化因子受体CCR5和CXCR4等，抑制这些分子的表达可以有效的抑制病毒复制和病毒感染过程[15-16]。此外，在体内外的研究均证实了RNAi在抗乙型肝炎病毒[17-18](hepatitis B virus，HBV)、抗(hepatitis E virus，HEV)[19]等病毒感染中的作用。RNAi已成为抗病毒感染治疗的有力工具。

3.2.3 RNAi与自身免疫性疾病 RNAi亦被用于自身免疫性疾病的研究。导致类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)关节退化的机制之一是滑膜细胞异常抗凋亡的存在,产生高水平的促炎细胞因子和金属蛋白酶。诱导细胞凋亡的是一种常见的死亡受体,其中大部分属于肿瘤坏死因子(TNF)的家庭。用抗TNF-α的单克隆抗体治疗可显著减少软骨和骨侵蚀[20]。用siRNA技术沉默疾病相关基因的表达对RA的治疗也具广泛的应用前景。如运用siRNA沉默树突细胞中的CD40、CD80、和CD86可抑制胶原诱导的关节炎的发生。慢病毒载体介导的TNF超家族成员B细胞激活因子的基因沉默，可抑制Th17细胞的增殖以改善小鼠中自身免疫性关节炎的病情[21]。Crispin等[22]用siRNA技术处理系统性红斑狼疮疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的T细胞，结果显示白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的分泌水平得以恢复。而IL-2的减少是SLE最主要的免疫病理学表现。RNAi为各种自身免疫病的治疗提供重要的理论和实验依据，并发挥着重要作用。

3.2.4 RNAi与神经系统疾病 阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常见的神经退行性疾病。对AD进行的RNA干扰的研究也最为深入。AD主要表现为脑组织淀粉性斑块和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)[23]。淀粉样斑块由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解过程产生的β淀粉样蛋白( β-amyloid protein，Aβ) 错误折叠组成。RNAi技术被用来减少体内的Aβ肽，其原理是作用于APP水解蛋白水解过程所需的酶(如BACE1)的表达或者直接作用于APP的表达[24-25]。在不同情况下，Aβ肽水平的明显减少与改善神经病理学和记忆相关的表型有关。AD另外一个病理学特点是NFTs，它是由高度磷酸化的Tau组成[26]，Tau是AD的另一个治疗靶点[27]。Tau似乎对于哺乳动物的功能来说并不是必不可少的，而且会引起一系列的神经退化性疾病[28]。虽然没有在AD模型的小鼠上直接以Tau的表达为目标研究，但有研究在转基因的AD小鼠模型上通过沉默细胞周期素依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)(CDK5是Tau高磷酸化所需要的酶)来阻碍NFTs的产生[29]。所以这项研究证实了CDK5也间接的证实了把Tau作为RNAi治疗AD的靶点的可行性。

4 结 语

RNAi现象一经发现就成为科学研究的一大热点，且在生物医学方面的研究成果斐然，但仍有一系列问题亟待解决。如RNAi的具体作用机制、病毒的逃逸、如何把理论上可行的治疗模型用于人体以及评价其作用效果等。相信随着RNAi的深入研究，RNAi有望在将来成为一种高度特异的以核苷酸为基础的基因治疗技术,不仅只应用在肿瘤、抗病毒等治疗中,甚至在功能性疾病的治疗中发挥巨大作用。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.024

2014-10-24；

2014-12-10

海南省重点科技项目资助(ZDXM20100042).

*通讯作者，E-mail：xnsun-0108@163.com.

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(此文编辑：朱雯霞)