青藤碱的免疫抑制作用机制的研究进展

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(南华大学附属第二医院泌尿外科，湖南 衡阳 421001)

·文献综述·

青藤碱的免疫抑制作用机制的研究进展

黎炼1，罗志刚2*

(南华大学附属第二医院泌尿外科，湖南 衡阳 421001)

器官移植是治疗终末期器官衰竭的最有效手段，但移植后的免疫排斥反应始终是移植面对的难题。目前的免疫抑制剂毒副作用大，明显降低了其治疗效果，寻找更好的防治移植排斥反应的方法是移植界的研究热点。青藤碱是从中药防己科植物青风藤中提取的一种生物碱,具有免疫抑制和抗炎作用，是一种有良好应用前景的新型免疫抑制剂。

青藤碱； 免疫抑制； 器官移植

器官移植是治疗终末期器官衰竭的最有效手段，手术后患者需长期服用免疫抑制剂以维系供体功能。目前的免疫抑制剂，缺乏特异性和选择性，使用时全面抑制机体的免疫功能，其中不少种类的药物仅在接近中毒量时才具有抑制免疫的效应，而且这类药物价格昂贵，部分患者因难以承担高昂的治疗费用而中断治疗。此外，患者极易因药物诱发肿瘤、机会菌感染及移植物失功等严重毒副作用，导致贫血、肝炎、糖尿病及骨病等不良反应。寻求安全低毒、有效、价廉的免疫抑制剂，始终是移植界需努力解决的目标。青藤碱(Alkaloid sinomenine，SIN)是从中药防己科植物青风藤中提取的一种生物碱单体,具有抗炎和免疫抑制等药理作用,临床上主要用于对类风湿性关节炎等各种风湿病以及心律失常的治疗。近年来随着对其免疫抑制作用研究的逐步深入,青藤碱也应用于移植免疫研究。

1 对免疫细胞的影响

免疫反应的产生首先是由抗原提呈细胞(APC)捕获抗原，经其加工处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞,从而引发一系列的特异性免疫应答。因此，在研究免疫反应时，抗原提呈细胞及其效应细胞如T、B淋巴细胞都是极其重要的研究对象。

1.1 对T细胞的影响

T细胞作为免疫反应的效应细胞，一直是器官移植界研究的热点。移植抗原有间接和直接两种识别途径。直接识别途径即受体T细胞直接识别供体APC的MHC类分子，从而诱发免疫应答，在早期排斥反应中起到关键作用。间接识别途径指受体T细胞识别自身APC处理过并递呈的供者特异性抗原，从而引发的免疫应答，在器官移植免疫远期起主要作用。

CD4+T细胞的活化是移植免疫发生的核心环节，一旦其充分活化，将产生众多的细胞因子，协调移植免疫反应的多种效应。李建军等[1]研究青藤碱(SIN)对CD4+T细胞内核因子-AT(NF-AT)和γ干扰素(IFN-γ)表达的影响，发现青藤碱能抑制CD4+T细胞的NF-AT和IFN-γ表达，并推测其可能是通过降低NF-AT的表达以抑制T淋巴细胞的活化和增殖。有研究[2]发现SIN能浓度依赖性地抑制人外周血CD4+T淋巴细胞增殖和细胞内Ca2+浓度升高，人外周血CD4+T淋巴细胞增殖抑制率和细胞内Ca2+浓度之间存在显著性负相关。SIN可抑制CCP-AST的体外活化、增殖[3]，并抑制其分泌IFN-γ水平，上调IL-4的表达[4]。SIN能显著降低肾移植小鼠外周血T淋巴细胞计数，主要抑制CD4+T细胞，对CD8+T细胞计数无明显影响，能降低CD4+T/CD8+T比值，并与环孢素A(CsA)有协同作用[5]。

调节性T细胞，全称CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Regulatory T Cells，Treg)，具有免疫抑制和免疫无能性。活化的Treg可以广泛抑制体内多种细胞的增殖[6]，如CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、DC、单核巨噬细胞等的活性。包括天然调节性T细胞(natural occurring regulatory T cell,nTreg)和诱导性调节性T细胞(induced regulatory T cells,iTreg)，近年来成为研究免疫反应的热点。Treg二者表达相似的膜表型分子，发挥类似的免疫抑制功能。在自身免疫疾病方面，iTreg能明显抑制实验性肠炎的发生[7]。疫苗诱导的iTreg可以预防和治疗Feldl引起的呼吸道过敏反应[8]，对于nTreg无治疗效果的Th17介导的自身免疫性胃炎发展的后期，抗原特异性iTreg也可能通过分泌趋化因子调节T细胞的迁移，最终逆转组织损伤，改善组织的功能[9]。Foxp3特定表达在细胞内，是Treg发育活化发挥功能的关键，并且不受活化状态的影响，被公认为是Treg的特异性标志。Treg的抑制效应具有剂量依赖性，Treg比例越大，其特征分子Foxp3表达越高，抑制功能越强[10]。调节性T细胞的产生和功能的维持所需的最为重要细胞因子是TL-2、TL-10与TGF等。蔡振刚等[11]建立大鼠肝移植模型，探讨SIN、CsA及两者联合应用对其的影响，发现SIN联合半量CsA促进IL-10分泌强于CsA组，同时促进了肝内淋巴细胞的凋亡，减轻了肝脏的病理损害。李凝等[12]分别抽取SIN组和双氯酚酸钠组RA患者治疗前、治疗后以及对照组健康体检者的外周静脉血，从细胞层面探讨SIN对辅助性T淋巴细胞(Th)17/调节性T淋巴细胞(Tregs)细胞比例的影响，发现SIN能抑制致炎细胞Thl7升高，提高具有免疫抑制作用的Tregs细胞数量。有实验[13]也发现SIN联合MTX治疗RA患者外周血中Treg水平明显升高而Thl7细胞含量明显降低，上述实验均提示SIN能上调Treg的数量，提示SIN具有免疫抑制作用。

1.2 对B淋巴细胞的影响

B淋巴细胞产生抗体，主要调控体液免疫。在器官移植界，细胞性免疫一直被认为主导移植排斥反应。随着抗体检测技术敏感性的逐渐提高，抗体在移植免疫中逐渐被重视。器官移植领域的国际知名专家Paul Terasaki综述了器官移植的体液免疫进展[14]，发现：(1)几乎所有的肾移植失败患者都发现存在HLA抗体，HLA抗体能引起肾移植的超急性排斥反应；(2)导致与早期肾移植失败相关的C4d在肾小球沉积，最后他得出了抗体是引发排斥的元凶这一结论。其在其另外一篇文献[16]中总结到，不同的实体器官移植均存在抗体相关排斥反应，且抗体出现在排斥发生前，说明抗体是器官移植排斥的原因。秦宁波等[16]根据接受诱导剂的不同将患者分为3组：淋巴细胞清除剂组；IL-2受体拮抗剂组及对照组，比较3组在1年内的排斥发生率和其他检测指标。发现急性排斥反应的发生率淋巴细胞清除剂组和IL-2受体拮抗剂组较对照组明显降低。

1.3 对树突状细胞(DC)的影响

树突状细胞是目前已知功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)，调节多种效应细胞的功能并在调控免疫应答中起核心作用。根据其成熟程度的不同分为成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC)和未成熟树突状细胞(immature dendritic cell，imDC)。mDC表面显著表达MHC分子、共刺激分子、粘附分子,体外激发同种异体淋巴细胞反应能力很强,是导致移植排斥反应的关键环节。imDC表面表达低水平的共刺激分子和黏附分子。高永翔等[17]研究发现，青藤碱刺激后的DC细胞表达HLA-DR、产生细胞因子和刺激同种同基因T细胞增殖的能力显著低于正常DC细胞，提示青藤碱可抑制DC的发育成熟和免疫应答功能。杨承英等[18]研究结果表明，合适剂量的SIN能刺激单核细胞分化为imDC，还能抑制其进一步成熟。

1.4 对单核/巨噬细胞(MO)的影响

单核细胞通过抗原提呈和释放细胞因子直接或间接活化辅助性T细胞，进而活化B细胞产生大量抗体。MO来源于单核细胞，活化后的MO参与到移植排斥的各个环节，包括吞噬、处理和提呈抗原，作为效应细胞损伤组织，调节免疫和修复组织。MO分泌了一系列促炎细胞因子[TNF-α,干扰素(IFN)、IL-1,IL-6,IL-8,]和生长因子[如血小板源性生长因子(PDGFs)，转化生长因子β，成纤维细胞生长因子和血小板活化因子等]导致组织损伤和组织硬化。青藤碱能呈浓度依耐性地提高巨噬细胞吞噬指数和吞噬率,降低巨噬细胞TNF-α、IL-6的表达，提示青藤碱能显著提高巨噬细胞吞噬能力[19]。有研究[20]发现盐酸青藤碱对小鼠腹腔巨噬细胞的配体刀豆素A和酵母多糖A内吞作用的影响时，发现当细胞外液含有SIN时，巨噬细胞内吞效应受到显著抑制。

2 对免疫分子的影响

免疫分子包括细胞因子、粘附因子、趋化因子等，其在免疫应答反应中发挥不可或缺的作用。目前青藤碱主要以细胞因子和粘附因子为研究对象。

2.1 对细胞因子的影响

细胞识别抗原后，产生细胞因子。IL-2、IFN-γ、IL-12等促使免疫细胞向Th1方向偏移，同时抑制Th2亚群分化，使应答偏向细胞性免疫，在移植界构成了细胞性急性排斥的基础。反之，IL-4、IL-5等促进Th2细胞发展，抑制Th1细胞增殖，发挥相应的免疫效应。Th1/Th2间的是否互相平衡直接影响机体的免疫功能。陈哲等[21]在研究青藤碱对变应性鼻炎的疗效及其作用机制时，发现青藤碱能降低变应性鼻炎的小鼠血清中Th2细胞因子IL-4及Thl细胞因子IFN-γ水平，且下降幅度以IL-4为显著。而程悦[22]在研究SIN对系膜增生性肾炎T细胞免疫失衡的调节作用时，也得出SIN能抑制Thl细胞因子IFN-γ的表达这一结论，并进一步发现SIN的这种调节作用随着SIN浓度的增加、治疗时间的延长而增强。IL-12是已知诱导Th1类应答的主要因子,诱导T细胞产生Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2,而成为效应性T细胞。SIN可抑制树突状细胞分泌IL-12。能够抑制混合淋巴细胞反应中淋巴细胞的增殖和增强骨髓充质干细胞(BMMSCs)免疫调节能力，其作用机制可能与促进Th2细胞因子分泌以及抑制Th1细胞因子分泌有关[23]。

炎症坏死或凋亡是细胞死亡的主要方式，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、干扰素γ(IFNγ)等参与了肾脏免疫性炎症的发病机制。SIN可明显降低TNF-α表达[24]，还抑制IL-10，抗dsDNA抗体蛋白含量和IL-10，TNF-αmRNA表达[25]。而有报道提出，白细胞介素6的表达水平与移植物的损伤程度存在一致性[26]。廖怀德等[27]建立大鼠肾移植模型，研究青藤碱对肾移植大鼠静脉血IL-6的影响，证实了青藤碱对大鼠移植肾起了比较确切的抗急性排斥反应，能明显下调IL-6的质量浓度并与环抱素A存在协同作用。

2.2 对粘附因子的影响

在器官移植排斥反应中多种粘附分子参与了免疫应答，ICAM-1是淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)的配体，通过ICAM-1与LFA-1的结合,参与抗原提呈反应。检测移植器官组织ICAM-1的表达水平可反映SIN对器官移植急性排斥反应的抑制程度。戴英波等[28]建立大鼠同种肾移植模型，研究SIN的免疫抑制作用及其与环抱菌素A(CsA)的协同效应，并探讨SIN免疫抑制作用的机制，观察到SIN可能通过下调ICAM-1表达抑制大鼠肾移植的急性排斥反应，并与CsA产生显著的协同作用，可减少CsA的用量，从而减轻其对移植肾的毒副作用。方敬[29]则改良大鼠模型，观察肾小球以及肾小管—间质的病理改变情况，采用免疫组织化学法检测ICAM-1的表达并分别进行半定量分析，实验表明青藤碱能够有效减轻肾脏病理损害，抑制大鼠肾组织ICAM-1的表达，延缓疾病进展。

2.3 SIN对核因子kB的影响

核因子-κB(NF-κB)是从B淋巴细胞核抽提物中检测到的核蛋白因子，其能通过调节许多蛋白如细胞因子、急性期反应蛋白和细胞粘附分子等的表达来调节免疫和炎症反应。活化后的NF-κB，能调节多种细胞因子表达增加,如肿瘤坏死因子TNFα、白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8、细胞间粘附分子ICAM-1等，影响机体的炎性反应，调控T、B淋巴细胞的增殖、生长和分化，在体液和细胞免疫中发挥重要作用。王春等[30]探究SIN对NF-KB核转位及IKBct降解的影响，发现SIN基本上把NF-KB阻滞在细胞质中，而细胞经脂多糖处理1h后，大部分NF-KB被转运到细胞核中，经SIN预处理细胞的细胞质中NF-KB含量为脂多糖组的2倍；脂多糖处理细胞1h后，50%的IKBc降解，但经SIN预处理细胞后，呈浓度依赖性抑制脂多糖诱导IKBa的降解。提示SIN可能通过阻断NF-KB的核转位以及IKBct的降解来抑制脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞IL-8的合成。姜浩等[31]在实验中发现SIN在一定程度上抑制了糖尿病大鼠视网膜NF-kB的活化，该作用可能通过降低DR中氧化应激水平的机制，抑制了蛋白激酶的激活来实现。

利用免疫抑制及抗炎的特性，青藤碱已在临床应用于风湿、类风湿性关节炎以及相关疾病脊椎炎和骨质增生的治疗，且疗效确切，副作用少，价格低廉，来源广泛。多个实验从免疫反应发生的不同环节验证了适当浓度的SIN具有良好的免疫抑制作用。完善青藤碱毒副作用机理及药代动力学研究，尽早应用于器官移植领域，已成为移植学界和制药界的目标，相信在不久的将来青藤碱有望成为推广使用的新型免疫抑制剂。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.022

2014-07-07；

2014-11-14

国家自然科学基金资助项目(81273754).

*通讯作者，E-mail:luo6398@sina.com.

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(此文编辑：蒋湘莲)