γ干扰素释放试验新试剂的临床应用研究

2015-01-22陈雪林邢俊蓬马亮亮崔嘉刘宇黑文明

中国防痨杂志 2015年5期

陈雪林邢俊蓬马亮亮崔嘉刘宇黑文明

·短篇论著·

γ干扰素释放试验新试剂的临床应用研究

陈雪林邢俊蓬马亮亮崔嘉刘宇黑文明

如何快速、准确诊断结核病一直是临床关注的问题。近年来，γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assays，IGRAs)作为一种新的辅助诊断结核分枝杆菌感染的免疫学方法，已经被广泛认可并应用于临床[1]；并且IGRAs对肺外结核、结核性胸膜炎的辅助诊断具有较高的敏感度和特异度[1-2]。目前IGRAs检测试剂有国产化倾向，武汉海吉力生物科技有限公司研制的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫吸附法)(简称“海吉力试剂”)，能够检测外周血的γ干扰素水平，与北京万泰生物药业有限公司生产的结核分枝杆菌相关γ-干扰素检测试剂盒(体外酶联免疫法)(简称“万泰试剂”)的检测原理一致，均选取了卡介苗及大多数非结核分枝杆菌没有的早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)作为结核分枝杆菌特异性抗原[3]，均可用于结核分枝杆菌潜伏感染或活动性感染的辅助诊断。本研究对海吉力试剂与万泰试剂在结核病诊断中的敏感度、特异度、一致率进行临床验证，结合临床资料探讨IGRAs对结核病患者的诊断价值。

对象和方法

1.对象：2013年1—4月在北京老年医院结核门诊、感染疾病科、呼吸科、肿瘤科招募研究对象，共入选结核病患者220例(结核病组)。其中涂阳或培阳结核病患者93例(菌阳组)，菌阴结核病患者127例(菌阴组)；男147例，女73例；年龄15～90岁，中位年龄36.0岁，其中≥60岁的老年患者44例；患者中肺结核181例(包括糖尿病合并肺结核患者20例)，结核性胸膜炎25例，肺外结核14例。

共入选非结核肺部疾病患者86例(非结核肺部疾病组)。其中男56例，女30例；年龄19～96岁，中位年龄72.0岁，其中≥60岁的老年患者59例；患者中肺炎54例，肺癌24例，慢性阻塞性肺疾病8例。

结核病的诊断标准参见文献[4]，同时综合考虑临床表现、影像学、组织病理学、抗结核治疗效果等，做出明确诊断。本研究获得我院伦理委员会审核通过，所有患者均签署知情同意书。

2.方法：每位入选受试者的全血标本用海吉力试剂与万泰试剂进行同步检测。

海吉力试剂检测步骤：用肝素锂抗凝采血管抽取静脉血>4 ml并马上颠倒混匀3次以上，使抗凝充分；3 h内将全血分装到以下3种管中，每管分装1 ml，以“N”标记本底对照培养管，以“T”标记加了结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10的测试培养管，以“P”标记加了非特异刺激原植物血球凝集素(PHA)的阳性对照培养管；分装前需要颠倒混匀3次以上，分装后轻柔颠倒培养管5次并立刻置于37 ℃培养箱中，静置培养(22±2)h后取出，离心收集上清液，然后用Multiskan MK3全自动免疫检测仪(上海赛默飞世尔仪器有限公司生产)检测其中γ干扰素的含量，再按说明书计算刺激培养系统中升高的γ干扰素的量来判定是否为结核分枝杆菌感染阳性。结果判定如下(参照说明书)：本底对照培养管γ干扰素含量值=N、测试培养管γ干扰素含量值=T、阳性对照培养管γ干扰素含量值=P(单位为IU/ml)；N≤8，T-N≥0.35并且≥N/4为阳性；N≤8，P-N≥0.5，T-N<0.35或≥0.35但

万泰试剂(批号TR20121205)检测步骤：检测步骤同上，结果计算(参照说明书)和判定的参考值如下：本底对照培养管γ干扰素含量值=N、测试培养管γ干扰素含量值=T、阳性对照培养管γ干扰素含量值=P(单位为pg/ml)；N≤400，T-N≥14并且≥N/4为阳性；N≤400，P-N≥20，T-N<14或≥14但400为不确定。

3.统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行分析。计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。一致率检验采用Kappa检验，Kappa值≥0.75为一致率高。

结果

1. 海吉力试剂与万泰试剂在结核病组、菌阳组、菌阴组的敏感度分别为80.9%(178/220)、79.6%(74/93)、81.9%(104/127)和78.2%(172/220)、77.4%(72/93)、78.7%(100/127)，差异均无统计学意义(Fisher确切概率法，P值分别为0.307、0.727、0.454)；海吉力试剂与万泰试剂在非结核肺部疾病组检测结果的敏感度分别为27.9%(24/86)、33.7%(29/86)，特异度分别为72.1%(62/86)、66.3%(57/86)，差异无统计学意义(Fisher确切概率法，P=0.125)。菌阴组与菌阳组的敏感度差异均无统计学意义(海吉力试剂：χ2=1.426，P=0.274；万泰试剂：χ2=0.289，P=0.625)。

2. 海吉力试剂与万泰试剂的一致率比较：两种试剂同时检测的306例样本中，均为阳性186例，均为阴性89例，结果一致率为89.9%(275/306)，Kappa值为0.775，具有很高的一致率。

3. 其他结果：海吉力试剂在肺结核、结核性胸膜炎患者中的敏感度分别为80.7%(146/181)、80.0%(20/25)，差异无统计学意义(χ2=0.057，P=0.805)；万泰试剂在肺结核、结核性胸膜炎患者中的敏感度分别为77.3%(140/181)、80.0%(20/25)，差异无统计学意义(χ2=1.207，P=0.314)；两者在糖尿病合并结核病患者中的敏感度分别为85.0%(17/20)、80.0%(16/20)，与未合并糖尿病的结核病患者中的敏感度比较，差异无统计学意义(海吉力试剂χ2=2.037，P=0. 152；万泰试剂χ2=0.671，P=0.439)。海吉力试剂在老年结核病患者的敏感度为61.4%(27/44)，低于在中青年结核病患者中的敏感度(84.7%，149/176)，差异有统计学意义(χ2=8.012，P=0.005)；万泰试剂在老年结核病患者中的敏感度为61.4%(27/44)，低于在中青年结核病患者中的敏感度(81.2%，143/176)，差异有统计学意义(χ2=4.856，P=0.028)。

讨论

1.γ干扰素释放试验在结核病诊断中的现状：目前IGRAs已有2个商业化试剂盒，即用酶联免疫吸附法检测的IFN-γ定量试验(QuantiFERON TB Gold In Tube，QFT GIT)和用酶联免疫斑点法检测的T-SPOT.TB试剂盒，主要目的是用于诊断结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)，近年来在结核病临床诊断中的应用越来越广[5]，对活动性结核病，尤其是肺外结核(结核性胸膜炎、淋巴结结核、骨关节结核等)也有辅助诊断价值[1-2，6-7]；但IGRAs检测结果受到外周血淋巴细胞绝对值、病变累及范围、年龄等因素的影响[8-9]，IGRAs检测试剂价格贵，国产IGRAs检测试剂的应用和报道较少；本研究使用的海吉力试剂与万泰试剂属前一种定量试验方法，均为国产试剂。

2.本研究的结果分析：海吉力试剂、万泰试剂对结核病组检测的敏感度分别为80.9%、78.2%，与结核病临床诊治进展年度报告(2013年)[5]中“Khalil等研究显示QFT-GIT诊断活动性结核病的敏感度为80%”的结论一致；两种试剂均对菌阳与菌阴结核病患者检测的敏感度差异无统计学意义，但有临床意义，有助于缓解菌阴结核病的诊断难题，提示IGRAs对菌阴结核病的诊断价值较高，与杨新婷等[8]报道“γ干扰素释放试验中IFN-γ分泌量不受菌量负荷影响”的结论一致；本研究中两种试剂对非结核肺部疾病患者检测的阳性率均高于国内李红等[10]报道的“T-SPOT.TB对非结核肺部疾病患者检测的阳性率[19.2%(30/156)]”，以此为对照，对结核病组诊断的特异度稍低于国内报道的“IGRAs诊断活动性结核病的特异度为78.1%～90.4%”[2,6-7,9-10]，可能说明我院(为结核病定点医院)非结核肺部疾病患者的结核潜伏感染率较高，提示在非结核肺部疾病患者中IGRAs检测结果阴性的排除诊断价值大于检测结果阳性的诊断价值；海吉力试剂和万泰试剂均对糖尿病合并结核病患者检测的敏感度较好，与未合并糖尿病的结核病患者的敏感度比较差异均无统计学意义，有较好的临床应用价值；在老年结核病患者中，海吉力试剂和万泰试剂检测的敏感度均低于在中青年结核病患者的敏感度，表明IGRAs对老年结核病患者的临床诊断价值相对较低。

综上所述，本次IGRAs新试剂的临床研究表明：海吉力试剂与万泰试剂对活动性结核病诊断的敏感度较高，以非结核肺部疾病为对照对结核病诊断的特异度稍低；两种试剂具有较好的一致性；IGRAs不失为快速、有效诊断各型结核病的辅助手段，尤其对菌阴结核病、糖尿病合并结核病患者的应用价值更高，对老年结核病患者的诊断价值相对较低；目前该技术的国产试剂适宜推广应用。

[1] 葛燕萍，肖和平.γ干扰素释放试验与结核菌素皮肤试验辅助检测肺外结核病的比较.中国防痨杂志，2014,36(3)：194-197.

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[3] 张立华，靳文香，贾红彦，等.T-SPOT与结核菌素试验对结核病患者的临床诊断价值.中华临床医师杂志(电子版)，2012,6(14)：4107-4108.

[4] 中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南.中华结核和呼吸杂志,2001,24(2)：70-74.

[5] 中国防痨协会结核病临床专业委员会.结核病临床诊治进展年度报告(2013年度).中国防痨杂志，2014,36(8)：714-740.

[6] 贾红彦，潘丽萍，刘菲，等.结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验对淋巴结结核的辅助诊断价值研究. 中国防痨杂志，2014,36(6)：467-471.

[7] 范俊，秦世炳，贾红彦，等.结核感染T细胞酶联免疫斑点试验与结核抗体检测在骨关节结核辅助诊断中的价值. 中国防痨杂志，2014,36(10)：884-887.

[8] 杨新婷，杨扬，杜凤娇，等.肺结核患者全血γ干扰素释放试验影响因素的探讨. 中国防痨杂志，2013,35(12)：1007-1012.

[9] 陈雪林，崔嘉，刘宇，等.两种全血γ-干扰素释放试验试剂盒在结核病诊断中的比较研究.中华临床医师杂志(电子版)，2013,7(24)：11380-11383.

[10] 李红，唐神结，史祥，等.全血γ-干扰素释放试验对涂阴肺结核诊断价值的研究. 中华临床医师杂志(电子版)，2012,6(16)：4894-4897.

(本文编辑：郭萌)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.015