结核病诊断中抗酸染色阳性对照芯片的制作及其应用

2015-05-25方伟建龚伟朱忆凌毛卫波黄渊陈国荣

中国防痨杂志 2015年5期

方伟建龚伟朱忆凌毛卫波黄渊陈国荣

·技术交流·

方伟建龚伟朱忆凌毛卫波黄渊陈国荣

近年来中国结核病发病率呈上升趋势[1]。结核分枝杆菌富含脂质和分枝菌酸，可耐受酸和乙醇脱色，通常采用萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色。在临床和流行病学中常用检查抗酸杆菌作为结核病诊断的依据，其中菌种鉴定为结核分枝杆菌是诊断结核病的金标准[2-3]。目前，尚无其他有效方法可替代抗酸染色，由于抗酸染色的阳性菌没有统一的判断标准，抗酸染色结果具有主观判读的不稳定性。另外，抗酸染色过程中影响因素较多，设置适当的对照在结核病抗酸染色实验中是质量控制的关键。组织芯片具有体积小、可操作性强、成本低和可比性强等特点，笔者利用组织芯片技术原理，改进芯片制作技术，在同一张切片上设立抗酸染色阳性对照，使得染色结果判断更为客观可靠，提高了抗酸杆菌的检出率，且方法简便可行，现介绍如下。

材料和方法

一、制作材料和试剂来源

从丽水市中心医院病理科2010—2013年的档案中筛选出经结核分枝杆菌DNA荧光探针检测为阳性，结核分枝杆菌丰富[结核分枝杆菌>10条/高倍视野(high power field，HPF)]且分布均匀的病理标本1例。同时查找此例患者临床治疗结果，确认经抗结核治疗有效，复查此例病理标本档案，从中选出原抗酸染色切片，获得抗酸染色呈强阳性(完全随机选择5个HPF，结核分枝杆菌均>10条/HPF)的组织蜡块。自制采样器(内径1.8 mm的平头穿刺套管一套)，载玻片(购自江苏世泰实验器材有限公司)，Z-N抗酸染色试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司)。本研究经丽水市中心医院伦理委员会审核同意实施。已征得阳性对照病理标本患者同意。

二、阳性对照芯片的制作

复查苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)切片与抗酸染色切片，选择最具代表性区域，画圈标记，再在组织蜡块上相应区域进行标记。用自制采样器，从供体蜡块中采集组织，取出1 cm×1 cm 包埋模具(日本樱花组织包埋机Tissue-Tek TEC 5自带模具)，先在模具底部加入少许石蜡，放置于加热台上使其熔化，待其完全熔化后放入所取组织芯，然后将模具移至冷却台稍冷却，使组织包埋面平整后按常规操作完成包埋。将组织芯片进行连续切片，厚度为4 μm，裱贴于载玻片的一端。于60 ℃烤箱内烤片约12 h后取出，储藏于干燥的切片盒内备用。

三、抗酸染色

当需要做抗酸染色时，从备用盒中取出1张对照芯片，将待检患者的活检病理组织蜡块进行切片后，裱于对照片旁边，用铅笔在载玻片上注明病理号和抗酸染色，然后同时进行烤片，切片脱蜡至水，入石炭酸复红染液，美蓝复染，脱水，透明封固(图1)。

图1 采样器、制成的蜡块与对照芯片

四、染色结果的判断

抗酸阳性杆菌为纤细，长约3 μm(变化幅度可以很大)、红染、不折光、稍弯的微细杆状物，或为稍弯的念珠样微细杆状物，与组织切片位于同一成像水平面上，位于巨噬细胞胞质内或位于细胞之外[4]。应用阳性对照芯片在行抗酸染色后，如果阳性对照芯片中抗酸杆菌清楚丰富(>10条/HPF)，说明抗酸结果可信。患者标本组织中如出现与阳性对照芯片中(>1条/HPF)一样的染色结果，则可判断该患者标本为抗酸染色阳性，如患者标本组织染色结果为阴性且阳性对照芯片中抗酸杆菌清楚丰富(>10条/HPF)，则可判断该患者标本为抗酸染色阴性。如果阳性对照芯片未查见抗酸杆菌，则说明抗酸染色失败，结果不可靠。如果阳性对照芯片中抗酸杆菌清楚、丰富，患者标本组织检测结果为阴性，因为两者的标本组织在同一切片上，染色处理过程相同，说明染色过程质量可信，患者标本组织检测结果的阴性为真阴性，可避免以往抗酸染色可能因为染色失败而导致的假阴性结果。

结果

在抗酸染色时需要对对照阳性芯片进行测试，以确保对照阳性芯片无皱褶与脱片。对照阳性芯片(图2)与待检组织相邻，界限清晰，易于阅片。并且不影响待检组织染色，对照阳性芯片中抗酸杆菌染色阳性清楚，抗酸杆菌丰富。显微镜下观察，对照阳性芯片排列规整，阅片者很容易相互参照查待检组织内的染色状况，可以根据阳性对照片的染色状况判定待检组织是否进行了正确的染色过程，并且可以参照已知的阳性对照片染色结果，给予待检组织内是否为抗酸杆菌较为客观的判读。丽水市中心医院病理科自2014年1月至2014年12月的186例患者抗酸染色均采用此方法，发现抗酸杆菌21例，阳性率为11.3%(21/186)。

左侧为阳性对照芯片，右侧为待检组织图2 抗酸染色结果模式图 (Z-N抗酸染色 ×400)

讨论

我国是全球结核病高负担国家，2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查显示：我国有5.5亿人感染结核分枝杆菌，活动性肺结核患者451万例(患病率367/10万)；菌阳肺结核患者196万例；每年死亡患者约15万例，是其他各种传染病与寄生虫病死亡总和的2倍[5]。正确及时诊断结核病可指导临床后期用药治疗，而在组织中找到抗酸染色阳性菌是确诊结核病的有力证据。在组织切片中抗酸染色检出阳性菌的比率较低，对抗酸染色呈阴性的患者，其他补充检测方法较少[6]。因此结核病诊断中抗酸染色的质量控制显得十分重要。

结核病诊断中进行抗酸染色时，为了确保染色片的质量和判读结果的准确性及可重复性，必须设立合理的对照，避免假阳性、假阴性结果，以及主观判读的不稳定性。而通常的抗酸染色一般没有设立对照实验，实验过程中操作步骤的时间差异、试剂是否过期、试剂的用量或其他人为因素等存在差异，均可能影响结果的准确性，使得抗酸染色结果的判读缺乏可靠性。因此，结核病诊断中设立抗酸染色阳性对照十分必要。

笔者运用组织芯片技术在结核病诊断抗酸染色时设立阳性对照具备以下优点：(1)待检组织和对照芯片在同一张载玻片上，在相同条件下进行抗酸染色，保证了实验条件的一致性，使结果更具可比性。(2)对照芯片面积很小，供体蜡块被破坏程度小。同时抗酸染色切片归档保存时不需要另外单独保存阳性对照切片，更有利于病理档案管理。(3)对照芯片阳性对照结果有利于对染色过程的质量控制。(4)对照芯片排列规整，与待检组织相邻，界限清楚，方便诊断医师阅片和查对。

总之，结核病诊断中抗酸染色设立阳性对照十分必要，手工自制对照阳性芯片方法简单，花费成本低，实用性强，值得临床推广应用。

[1] 吴龙章,刘燕文,钟炳棠.分枝杆菌的实验室检查与质量控制.中国防痨杂志，2014，36(4):286-289.

[2] 马玙，朱莉贞，潘毓萱. 结核病. 北京：人民卫生出版社，2006：100-104．

[3] 周新华. 重视结核病的影像学分析与影像技术. 中国防痨杂志，2014，36(3):145-148.

[4] 赵天如，徐东明，杨晶，等. 抗酸染色阳性菌的辨认与假阳性异物的识别. 诊断病理学杂志，2003，10(2):121.

[5] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室．2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志,2012,34(8): 485-508.

[6] 胥维勇.氧化剂和表面活性剂在抗酸染色中的应用.临床与实验病理学杂志，2013，29(1)：103-104.

(本文编辑：郭萌)

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