趋化因子CCL22对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

管彩虹 赵 凯 楼雅芳 朱黎红 吴 清

趋化因子CCL22对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

管彩虹1赵 凯2楼雅芳1朱黎红1吴 清1

目的观察趋化因子CCL22对肺癌SBC-5细胞迁移和侵袭能力的影响。方法取肺癌细胞系SBC-5细胞，RPMI-1640培养基培养，5%CO2培养箱孵育，清洗消化后传代培养。予100ng/mL的 CCL22诱导肺癌 SBC-5细胞，设 Control组、CCL22组（100ng/mL）、MIX 组（CCL22 100ng/mL+蛋白激酶抑制剂U0126 10μmol），观察细胞迁移及侵袭能力的变化；加入蛋白激酶抑制剂（U0126）后细胞迁移及侵袭能力的变化。结果CCL22诱导肺癌SBC-5细胞后，CCL22组细胞迁移距离（351.9±16.4）μm，明显大于 Control组的（112.6±27.2）μm 和 MIX 组的（145.1±29.6）μm（P＜0.05），MIX 组和Control组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CCL22组平均侵袭细胞数（505.5±66.3）个，显著高于 Control组的（199.2±32.8）个和 MIX 组的（95.7±19.1）个（P＜0.05），MIX 组明显低于 Control组（P＜0.05）。结论趋化因子CCL22可在体外诱导肺癌SBC-5细胞迁移和侵袭，而蛋白激酶抑制剂（U0126）可抑制CCL22诱导肺癌细胞的迁移及侵袭。

肺癌细胞；趋化因子CCL22；肿瘤侵袭；肿瘤转移

肺癌常发生骨、肝脏等远处转移，在癌细胞转移过程中，靶器官的趋化作用至关重要。既往研究发现，分化的破骨细胞可产生趋化因子CCL22，其相应的受体为CCR4。我们通过实验观察趋化因子CCL22能否诱导可表达CCR4的肺癌细胞（SBC-5细胞）发生迁移和侵袭，为肺癌转移机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 肺癌细胞系SBC-5（广州吉妮欧生物科技有限公司）；RPMI-1640培养基（SIGMA公司）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司）；蛋白激酶抑制剂（U0126，SIGMA 公司）；PVDF膜（Millipore公司）；ECL Plus发光试剂盒、Western及IP细胞裂解液（碧云天公司）；倒置相差显微镜（ECLIPSE Ti-S型，Nikon公司）；流式细胞仪（Accuri C6型）和24-well transwell（BD公司）；凝胶成像仪（Bio-RAD公司）；其他试剂系国产分析纯试剂。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养 SBC-5细胞常规复苏，用10%FBS1×P.S.RPMI-1640培养基 37℃，5%CO2培养箱孵育培养，磷酸盐缓冲液（0.01M PBS）清洗，0.25%Trypsin消化细胞进行传代培养并调整细胞状态。

1.2.2 细胞迁移能力检查 采用划痕实验。取对数生长期细胞，0.25%Trypsin消化、细胞计数，以1×106/孔细胞量布6孔板，待细胞贴壁后，以1%FBS RPMI-1640培养基同步化24h。垂直于平行线用200μL枪头垂直6孔板布满细胞底部划线。用无血清RPMI-1640培养基漂洗两遍。在显微镜下选择背景最好的三个区域拍照（×100）。设 Control组、CCL22 组（100ng/mL）、MIX 组（CCL22 100ng/mL+蛋白激酶抑制剂U0126，10μmol），每组完全培养基加入相应药物，37℃，5%CO2培养箱孵育24h。在相差显微镜下观察各组三个选择区域24h后的迁移情况，拍照（×100）。

1.2.3 Transwell试验观察细胞侵袭能力 取对数生长期细胞，以1%FBS RPMI-1640培养基同步化24h。将在4℃融好的Matrigel用冷的无血清RPMI-1640培养基稀释，取100μL稀释胶（～25μg）加到24-well transwell上室。放置37℃孵育过夜包被基底膜，取出transwell板，用无血清RPMI-1640培养基轻洗凝胶。取同步化24h细胞0.25%Trypsin消化，收集，计数。制备 5×106/mL，1%FBS RPMI-1640 细胞悬液。取200μL加入上室，下室加入600μL各组培养基。每组完全培养基加入相应药物，37℃，5%CO2培养箱孵育24h。用棉签擦去上室非侵袭细胞，移去transwells，倒置，风干。在24孔板中加入500μL含0.1μg结晶紫，把小室放入其中，37℃孵育30min。取出，PBS清洗。直径上取四个视野，拍照（×100），计数。

1.3 统计学方法 检测数据用均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS13.0软件对样本数据进行t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCL22对SBC-5细胞迁移能力影响 CCL22诱导SBC-5细胞后，Control组细胞平均迁移距离（112.6±27.2）μm，CCL22 组 细 胞 平 均 迁 移 距 离（351.9±16.4）μm，MIX 组细胞平均迁移距离（145.1±29.6）μm。CCL22组细胞迁移距离明大于 Control组和MIX组（P＜0.05），MIX组和Control组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图 1～2（插页）。

2.2 CCL22对SBC-5细胞侵袭能力影响 CCL22诱导SBC-5细胞24h后，穿过基地面细胞数以平均侵袭细胞数±样本标准差表示。Control组平均侵袭细胞数（199.2±32.8）个，CCL22组平均侵袭细胞数（505.5±66.3）个，MIX组平均侵袭细胞数（95.7±19.1）个。CCL22组显著高于Control组和MIX组（P＜0.05），MIX组明显低于 Control组（P＜0.05），见图3～4（插页）。

3 讨 论

研究[1]证实，靶器官产生的一些细胞因子（如白介素、细胞核因子κB配基受体激活剂、趋化因子等）与肿瘤细胞表达的特异性受体结合，在肿瘤细胞的迁移种植过程中发挥着重要作用。

趋化因子家族是一类由免疫或非免疫细胞分泌的一级结构相似的小分子蛋白，具有多种生物活性，根据其氨基酸序列上前两个半胱氨酸相对位置不同，可以分为4类，CCL22就是其中一类，在人体中位于16号染色体的CCL22基因编码上，由树突细胞和巨噬细胞分泌产生。Nakamura等[2]研究发现分化的破骨细胞也可产生趋化因子CCL22，其相应的受体为 CC 趋化因子受体 4（CCR4）。Phillips等[3]证实了趋化因子CXCLl2及其相应受体CXCR4在非小细胞肺癌嗜器官转移中具有重要作用。本实验应用100ng/mL的CCL22处理肺癌SBC-5细胞，24h后细胞转移和侵袭能力明显增加，说明肺癌转移过程不是随机的，而是有靶器官趋向性。因此，靶器官组织中的趋化因子和肺癌细胞中的特异性受体同时高表达在肺癌的器官特异性转移的过程中起着非常关键的作用。

本研究还发现加入蛋白酶抑制剂U0126后，肿瘤细胞的迁移和侵袭性明显减弱。以往的研究显示U0126主要是抑制细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化[4]，ERK可将细胞外刺激传递至细胞内，参与细胞的生长、发育、分化等一系列生理活动，并在细胞的恶性转化和肿瘤的发展中起重要作用。赵凯等[5]研究发现，ERK/MAPK信号转导通路在乳腺癌骨转移中被明显激活。所以除了趋化因子参与肿瘤转移外，是否还有其它因子或酶参与，有待进一步研究。

因此，肿瘤的转移部位不是随机性，而是有一定的趋向性，趋化因子CCL22在体外可以诱导肺癌SBC-5细胞迁移和侵袭，蛋白激酶抑制剂（U0126）可以抑制CCL22诱导肺癌细胞迁移及侵袭。实验结果可能会为肺癌转移的治疗提供新的实验依据。

［1］ Vander Griend DJ，Rinker Schaeffer CW.A new look at an old problem：the survival and organ-specific growth of metastases［J］.Sci STKE，2004，（216）：3-9.

［2］ Nakamura Es，Koizumi K，Kobayashi M，et al.RANKL-induced CCL22/macrophage-derived chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung cancer expressing its receptor CCR4［J］.Clin Exp Metastasis，2006，23（1）：9-15.

［3］Phillips RJ，Burdick MD，Lutz M，et a1.The stromal derived Factor-1/CXCLl2-CXC chemokine recenter-4 biological axis in non small cen lung cancer metastases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，167（12）：1676-1681.

［4］Ahn NG，Nahreini TS，Tolwinski NS，et al.Pharmacologic inhibitors of MEK1 and MEK2［J］.Methods Enzymol，2001，332：417-431.

［5］赵凯，谭群亚，杨翀，等.干扰ERK/p-38 MAPK信号通路对乳腺癌骨转移的影响［J］.中华实验外科杂志，2011，28（2）：311.

（收稿：2014-06-20 修回：2014-08-01）

Effects of Chemokine CCL22 on Lung Cancer Cell Migration and Invasion

GUAN Caihong1，ZHAO Kai2，LOU Yafang1，ZHU Lihong1，WU Qing1.1 Department of Respiratory Medicine,Hangzhou TCM Hospital,Hangzhou(310009),China;2 Department of Surgery,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou（310003），China

Objective To investigate the effect of chemokine CCL22 on migration and invasion of lung cancer cell line SBC-5.MethodsLung cancer cell line SBC-5 cells were cultured with RPMI-1640 medium and incubated in an incubator with 5%CO2,then the cell was washed and digested to subculture.The SBC-5 cells subcultured were divided into control group,CCL22 group（100ng/mL）,and MIX group（CCL22 100ng/mL+protease inhibitor U0126 10μmol）.The cells were treated with the corresponding drugs in each group.Capability of lung cancer cell migration and invasion was observed after treatment in each group.ResultsAfter induction with CCL22,the migration distance of SBC-5 cells was increased（351.9±16.4μm）compared with that in control（112.6±27.2μm）and MIX group（145.1±29.6μm,all P＜0.05）;no significant difference in the migration distance was noted between control and MIX groups（P＞0.05）.Cell invasion in CCL22 group（505.5±66.3） was seen more than that in control（199.2±32.8）and MIX groups（95.7±19.1,all P＜0.05）,and a significant difference was found between the latter two groups（P＜0.05）.ConclusionChemokine CCL22 can induce migration and invasion of lung cancer cell line SBC-5 in vitro,while protease inhibitor（U0126）may inhibit the migration and invasion of lung cancer cells induced by CCL22.

lung cancer cells；chemokine CCL22；tumor invasion；tumor migration

p

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2011KYA138）；杭州市医药卫生科技计划项目（No.2011A046）

1杭州市中医院呼吸科（杭州 310009）；2杭州市红十字会医院外科（杭州 310003）

赵凯，E-mail：zhaokaiguan@126.com