红酵母发酵生产β-胡萝卜素培养基配方的优化

■马歌丽 杜聪聪 张 威 索军阳

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002）

类胡萝卜素是一类普遍存在于动物、高等植物、真菌和藻类中的黄色、橙红色或红色的色素[1-3]。β-胡萝卜素是类胡萝卜素的典型代表，被广泛用作食品着色剂、营养强化剂和化妆品着色剂[4-5]。医学研究还发现，β-胡萝卜素在提高机体免疫活性、防治癌症和心血管病等方面颇具生理活性功能[6-9]。

β-胡萝卜素的生产方法有化学合成法、植物提取法和微生物发酵法三种。化学合成的食用色素因毒性问题使其在食品工业中的应用受到限制；而从植物中提取天然色素存在成本高、价格贵和工艺复杂等不足[10-11]；微生物发酵法生产β-胡萝卜素因成本低和不受环境条件限制越来越受到重视[12-13]。产β-胡萝卜素的微生物主要有三孢布拉霉菌和红酵母[14]。虽然红酵母发酵生产β-胡萝卜素的水平没有三孢布拉霉菌的高，但红酵母属于我国饲料行业12种确认的饲用微生物之一，具有生长周期短、营养要求简单和菌体可综合利用等特点，因此，利用红酵母发酵生产β-胡萝卜素具有广阔的开发应用前景[15-16]。目前，红酵母发酵生产β-胡萝卜素面临的最大问题是β-胡萝卜素的产量偏低，尚未达到工业化生产水平[17-19]。提高红酵母发酵生产β-胡萝卜素产量的途径主要有通过生物技术手段筛选高产菌株、优化发酵培养基配方和优化发酵条件等[20]。本研究主要对红酵母发酵产β-胡萝卜素的发酵培养基配方进行优化，以期提高红酵母摇床发酵生产β-胡萝卜素的产量，为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

红酵母由郑州轻工业学院生物工程实验室筛选菌种。

1.2 培养基

活化培养基：葡萄糖20 g/l、蛋白胨20 g/l、酵母粉10 g/l、琼脂20 g/l，pH值自然。

种子培养基：葡萄糖40 g/l、蛋白胨10 g/l、酵母粉10 g/l，pH值自然。

初始发酵培养基：葡萄糖40 g/l、蛋白胨10 g/l、酵母粉10 g/l，调pH值6.0。

所有培养基均于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20 min。

1.3 红酵母的培养

菌种活化：挑取红酵母菌种转接至活化培养基斜面，于28℃恒温培养48 h。

种子培养：用接种环挑取活化斜面培养基上长势较好的红酵母至装液量为50 ml/250 ml三角瓶种子培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养24 h。

揺瓶发酵培养：将种子培养液以5%的接种量接到装液量为100 ml/250 ml三角瓶发酵培养基中，于28℃、180 r/min恒温振荡培养70 h。

1.4 生物量的测定

将发酵液3 000 r/min离心15 min，弃上清液，菌体沉淀用蒸馏水洗涤两次，收集菌体，于烘箱中60℃烘干至恒重，称量得红酵母生物量，记为M(g/l)。

1.5 β-胡萝卜素的提取和测定

1.5.1 β-胡萝卜素的提取

准确称取0.1 g烘干的红酵母菌体于5 ml 3 mol/l的盐酸中，室温振荡1 h，沸水煮6 min，迅速冷却，3 000 r/min离心15 min弃上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，溶于5 ml丙酮中，于室温振荡30 min，10 000 r/min离心10 min，上清液即为β-胡萝卜素提取液。将β-胡萝卜素提取液适当稀释，用UV-2600型分光光度计在475 nm处测定吸光度。

1.5.2 β-胡萝卜素含量的测定

①β-胡萝卜素含量的计算：

式中：C——β-胡萝卜素含量(μg/g干菌体)；

Aλmax——475 nm处胡萝卜素的吸光度；

D——试样的稀释倍数；

V——提取用丙酮体积(ml)；

0.16——胡萝卜素的摩尔消光系数；

W——红酵母干菌体质量(g)。

②β-胡萝卜素产量的计算：

Y=M×C。

式中：Y——β-胡萝卜素产量(mg/l)；

M——红酵母生物量(g/l)；

C——β-胡萝卜素含量(μg/g干菌体)。

2 结果与讨论

2.1 红酵母生长曲线的测定

将振荡培养24 h的种子培养液，以5%接种量接种于发酵培养基中，于28℃、180 r/min培养。每隔4 h取10 ml培养液，测定红酵母生物量。以培养时间为横坐标，生物量为纵坐标绘制红酵母生长曲线，结果如图1所示。

图1 红酵母生长曲线

由图1可知，红酵母的延滞期为0～12 h，指数期为12～28 h，稳定期为28～72 h，72 h之后红酵母进入衰亡期。在指数期，细胞以几何级数增长，生长速率常数最大，细胞平衡生长，代谢旺盛，以指数期的种子接种，可以大大降低培养物的延滞期，因此选择24 h为种龄。

2.2 红酵母产β-胡萝卜素发酵曲线的测定

将振荡培养24 h的种子培养液，以5%接种量接种于发酵培养基中，于28℃、180 r/min培养。每隔4 h取10 ml发酵培养液，离心弃上清液，菌体沉淀反复用蒸馏水洗涤后烘干，参照1.5方法进行β-胡萝卜素的提取和测定。以培养时间为横坐标，β-胡萝卜素产量为纵坐标，绘制红酵母产β-胡萝卜素的发酵曲线，结果如图2所示。

图2 红酵母产β-胡萝卜素发酵曲线

从图2可以看出，在菌体生长0～30 h之间，红酵母不产β-胡萝卜素；30 h之后，β-胡萝卜素逐渐形成；30～68 h之间，β-胡萝卜素的量呈上升趋势，直至68 h β-胡萝卜素的积累量达到最大。68～72 h之间，β-胡萝卜素的产量趋于平稳，72 h后β-胡萝卜素的产量逐渐降低。根据红酵母产β-胡萝卜素积累量在菌体生长的稳定期达到最大推断，β-胡萝卜素属于红酵母的次级代谢产物。因此，红酵母菌体的收集及色素的提取选择在70 h进行。

2.3 红酵母发酵生产β-胡萝卜素培养基配方的优化

2.3.1 碳源对红酵母产β-胡萝卜素的影响

分别选取40 g/l的蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖和可溶性淀粉代替葡萄糖作为发酵培养基中的唯一碳源，其余培养基成分不变，发酵培养基接种红酵母后于28℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量。碳源种类对红酵母产β-胡萝卜素的影响如图3所示。

图3 碳源种类对红酵母产β-胡萝卜素的影响

碳源是组成培养基的主要成分之一，它既供给酵母细胞生命活动所需要的能量，又是类胡萝卜素碳架的来源，因此，适宜的碳源可以促进菌体的生长和β-胡萝卜素的生成。由图3可以看出，碳源种类对红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响较大。以葡萄糖为唯一碳源时β-胡萝卜素的产量最高，蔗糖次之，可溶性淀粉最低。从工业利用角度考虑，大规模发酵生产中的葡萄糖可通过水解淀粉得到。综合考虑，选取葡萄糖作为红酵母发酵产β-胡萝卜素的最佳碳源。

2.3.2 葡萄糖浓度对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以葡萄糖为碳源，葡萄糖浓度分别为10、20、30、40、50 g/l和60 g/l，其余培养基成分不变，将发酵培养基接种后于28℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量。葡萄糖浓度对红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响如图4所示。

由图4可见，当葡萄糖浓度在10～40 g/l时，β-胡萝卜素的产量呈递增趋势；当葡萄糖浓度为40～50 g/l时，β-胡萝卜素产量达到最大值；当葡萄糖浓度高于50 g/l时，β-胡萝卜素的产量缓慢下降。由此可知，葡萄糖浓度对红酵母发酵产β-胡萝卜素有较大影响，葡萄糖浓度过高或过低都不利于β-胡萝卜素的生成。当葡萄糖浓度低于40 g/l时，培养基中所含碳源不能满足红酵母生长和β-胡萝卜素合成的需要，导致菌体生长缓慢，产物积累较少；当葡萄糖浓度高于50 g/l时，可能引起培养液的黏度增加，溶氧量降低，也可能导致酵母细胞质壁分离，进而β-胡萝卜素产量降低。因此，葡萄糖浓度初步确定为40 g/l。

图4 葡萄糖浓度对红酵母产β-胡萝卜素的影响

2.3.3 氮源种类对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以40 g/l葡萄糖为碳源，分别选取20 g/l的蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸铵以及10 g/l蛋白胨与10 g/l酵母粉复合物为氮源，在其余培养基成分不变的条件下，将发酵培养基接种后于28℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量。氮源种类对红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响如图5所示。

图5 氮源种类对红酵母产β-胡萝卜素的影响

由图5可见，以酵母粉为氮源时最有利于酵母生成β-胡萝卜素，蛋白胨和酵母粉构成的复合氮源次之，再者为牛肉膏、蛋白胨，无机氮源硫酸铵作为氮源不利于β-胡萝卜素的生产。因此确定酵母粉为最佳氮源。

2.3.4 酵母粉添加量对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以40 g/l葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源，酵母粉添加量分别为5.0、10.0、15.0、20.0 g/l和25.0 g/l，在其余培养基成分不变的条件下，将发酵培养基接种后于28℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量。酵母粉添加量对红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响如图6所示。

图6 酵母粉添加量对红酵母产β-胡萝卜素的影响

由图6可知，当酵母粉添加量在5～20 g/l时，β-胡萝卜素的产量呈递增趋势，当酵母粉添加量高于20 g/l时，β-胡萝卜素的产量呈下降趋势。与葡萄糖浓度对红酵母产β-胡萝卜素的影响类似，酵母粉添加量过高或过低也不利于菌体的生长和代谢产物的积累。因此，酵母粉添加量初步确定为20 g/l。

2.3.5 无机盐对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以40 g/l葡萄糖为碳源，20 g/l酵母粉为氮源，分别添加 0.5 g/l的 CuSO4、MgSO4、FeSO4、K2HPO4、NaCl和CaCl2，在其余培养基成分不变的条件下，将发酵培养基接种后于28℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量。无机盐对红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响如图7所示。

图7 无机盐对红酵母产β-胡萝卜素的影响

无机盐在构成细胞分子、调节渗透压及胞内pH值等方面具有重要的功能。由图7可知，与对照组相比，添加适量的MgSO4能促进β-胡萝卜素的积累。K2HPO4和NaCl对β-胡萝卜素的积累影响不大，而Cu-SO4、FeSO4和CaCl2均对β-胡萝卜素的生产有抑制作用。因此，选择0.5 g/l MgSO4作为红酵母产β-胡萝卜素发酵培养基中的无机盐。

2.3.6 维生素对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以40 g/l葡萄糖为碳源、20 g/l酵母粉为氮源，考察不同浓度的VB1、VB2对红酵母发酵产β-胡萝卜素的影响，结果如图8所示。

图8 维生素对红酵母产β-胡萝卜素的影响

生长因子是一类调节微生物正常代谢所必需的有机物，狭义的生长因子一般仅指维生素。由图8可以看出，VB1和VB2对β-胡萝卜素的产量均有影响。从胡萝卜素产量提高程度方面分析，VB2对β-胡萝卜素产量的提高更大。同时，由图8也可以看出，维生素添加过多或过少均起不到提高β-胡萝卜素产量的作用。因此，确定VB1和VB2的最佳添加量分别为0.5 mg/l和1.5 mg/l。

2.3.7 发酵培养基初始pH值对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以40 g/l葡萄糖为碳源、20 g/l酵母粉为氮源，添加 0.5 g/l MgSO4、0.5 mg/l VB1和 1.5 mg/l VB2，分别调节发酵培养基初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，发酵培养基初始pH值对β-胡萝卜素的影响如图9所示。

图9 发酵培养基初始pH值对红酵母产β-胡萝卜素的影响

由图9可知，发酵培养基的初始pH值对红酵母发酵生产β-胡萝卜素有较大影响。在偏酸性的环境中，红酵母发酵β-胡萝卜素的产量较高。另外，从工业生产的角度考虑，偏酸性的环境可以抑制杂菌的生长，这对色素的大规模生产极为有利。因此，发酵培养基的初始pH值初步确定为6.0。

2.3.8 装液量对红酵母产β-胡萝卜素的影响

以40 g/l葡萄糖为碳源、20 g/l酵母粉为氮源，添加 0.5 g/l MgSO4、0.5 mg/l VB1和 1.5 mg/l VB2，调节发酵培养基初始pH值为6.0，在250 ml三角瓶中分别装入40、60、80、100、120 ml的发酵培养基，接种后于28℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量。装液量对红酵母产β-胡萝卜素的影响如图10所示。

由图10可知，装液量为60 ml/250 ml时红酵母发酵β-胡萝卜素产量较高。随着装液量的增加，β-胡萝卜素的产量逐渐下降。装液量主要影响发酵培养基中的溶氧量，随着装液量的增加，单位体积发酵培养基中的溶氧量降低，菌体生长缓慢，进而导致β-胡萝卜素产量的下降。在工业生产中，除了控制装液量外，也可以采用提高发酵罐搅拌速度或者补充氧气的方法来控制培养基中的溶氧量从而提高β-胡萝卜素的产量。因此，发酵培养基装液量确定为60 ml/250 ml。

图10 装液量对红酵母产β-胡萝卜素的影响

2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选取对红酵母产β-胡萝卜素影响较大的四个因素即葡萄糖浓度(A)、酵母粉添加量(B)、发酵培养基初始pH值(C)、装液量(D)，每个因素选取三个水平，按L9(34)进行试验，以不接种的培养液为对照，以β-胡萝卜素产量为指标优化发酵培养基配方。正交试验设计因素水平如表1所示，正交试验结果与分析如表2所示。

表1 因素水平设计

表2 正交试验结果与分析

从表2的极差分析结果可见，各因素对β-胡萝卜素产量影响的主次顺序为A＞C＞D＞B，即葡萄糖浓度是影响红酵母发酵产β-胡萝卜素的主要因素，其次为发酵培养基初始pH值、装液量和酵母粉添加量。通过表2的结果可以看出，β-胡萝卜素的最高产量为3.815 mg/l，对应的因素水平组合为A2B3C1D2。从表2的较优水平分析可知，红酵母发酵产β-胡萝卜素的最佳组合为A2B3C2D2，即葡萄糖浓度为40 g/l、酵母粉添加量为25 g/l、发酵培养基初始pH值6.0、装液量为60 ml/250 ml，为验证此条件下的β-胡萝卜素的产量，需进行验证试验。

2.5 验证试验

采用正交试验分析得到的最佳条件组合A2B3C2D2，即葡萄糖 40 g/l，酵母粉 25 g/l、0.5 g/l Mg-SO4、0.5 mg/l VB1、1.5 mg/l VB2、发酵培养基初始 pH值 6.0、装液量60 ml/250 ml，于28 ℃、180 r/min培养70 h，收集菌体并测定β-胡萝卜素产量，以验证正交试验的分析结果，验证试验结果如表3所示。

表3 验证试验结果

由表3可知，在最佳条件下，红酵母发酵β-胡萝卜素的产量达到3.865 mg/l，该结果不仅高于表2中的最高值3.815 mg/l，而且与优化前β-胡萝卜素的产量2.368 mg/l（见图2）相比，提高了63.2%。

3 结论

通过单因素试验和正交试验，得到红酵母发酵产β-胡萝卜素的最佳培养基配方为：葡萄糖40 g/l、酵母粉 25 g/l、MgSO40.5 g/l、VB10.5 mg/l、VB21.5 mg/l、发酵培养基初始pH值6.0、装液量60 ml/250 ml。运用该优化培养基配方将红酵母于28℃、180 r/min培养70 h，β-胡萝卜素产量达到3.865 mg/l，与优化前β-胡萝卜素产量2.368 mg/l相比，提高了63.2%。