XIP木聚糖酶抑制蛋白对不同家族木聚糖酶的抑制作用
2015-01-21刘新育王梦迪焦雪苗郜艳敏陈红歌
■刘新育 王梦迪 焦雪苗 郜艳敏 陈红歌
（河南农业大学农业部农业微生物酶工程重点实验室，河南郑州 450002）
木聚糖是小麦等谷物饲料中主要的抗营养因子，它可以通过增加动物消化道食糜黏度，阻断细胞中养分的释放，降低饲料利用率，最终导致动物生产性能下降[1]。因此，如何消除木聚糖的抗营养作用是影响开发谷物、糠麸类饲料资源的一个关键因素。木聚糖酶可以切割主链内部的糖苷键而将木聚糖水解，降解产物分别为低聚木糖或木糖[2]，对解除木聚糖引起的抗营养作用较为关键[3]。根据木聚糖酶催化结构域氨基酸的同源性,将其归为糖苷水解酶GH10家族和GH11家族（http://www.cazy.org/）。
然而Debyser等[4]发现小麦中存在对木聚糖酶活性具有抑制作用的蛋白成分，近几年研究发现木聚糖酶抑制蛋白在小麦、玉米、水稻、大麦、黑麦、燕麦和高粱中广泛存在[5]。根据Gebruers等[6]的估算，小麦中抑制蛋白的含量远大于饲料中木聚糖酶的添加量，因此，理论上推测这些抑制蛋白会对外加酶造成负面影响。由英国ADAS咨询公司和Danisco动物营养分公司联合发布的英国国家粮食局项目的调查报告[7]中，建议对欧洲地区木聚糖酶抑制蛋白含量较高的小麦品种用作饲料时，应该施加更高用量的木聚糖酶。因此，研究木聚糖酶抑制蛋白对不同种类木聚糖酶的抑制性质，可用来确定GH10和GH11木聚糖酶中哪一类酶更适合用于饲料添加，以便最大程度地发挥其酶活性。
1 材料和方法
1.1 试验材料
小麦木聚糖酶抑制蛋白由河南农业大学酶工程实验室利用重组毕赤酵母GS115表达生产，黑曲霉GH10木聚糖酶来自于本实验室构建的大肠杆菌重组表达，哈茨木霉GH11木聚糖酶来自于市售，山毛榉木聚糖购自Sigma公司。
1.2 主要仪器
UV-2550紫外-可见分光光度计（日本SHIMADZU公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 DNS反应液
取酒石酸钾钠182 g，溶于500 ml水中，放入低于50℃水浴中加热，在热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3 g、1%的NaOH 20.96 g、苯酚5 g、亚硫酸钠5 g，搅拌使它们溶解，冷却后定容至1 000 ml，贮藏于棕色瓶中静置一周后使用。
1.3.2 木聚糖酶和木聚糖酶抑制蛋白的浓度测定
利用考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质浓度。将0.8 ml的蛋白液加入1.6 ml的考马斯亮蓝溶液，反应10 min之后在波长595 nm下测定吸光值，再利用标准曲线y=0.006 1x+0.082 7通过代入吸光值y，求出蛋白质浓度。
1.3.3 木聚糖酶酶活测定
取0.1 ml粗蛋白提取液，加入0.1 ml 2%山毛榉木聚糖（Sigma）底物溶液（用0.2 mol/l、pH值4.6的HAC-NaAC缓冲液配制），在50℃保温15 min后，立即加入0.6 ml DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂，煮沸10 min显色，定容至5 ml，于550 nm波长下测定还原糖含量(以木糖计)，每个样品设三次重复。在上述条件下，以每分钟产生1 μmol木糖所需的酶量为1个酶活力单位（IU）。
1.3.4 木聚糖酶抑制活性的测定及抑制率的计算
适当稀释木聚糖酶液，使其木聚糖酶活力测定OD550nm值在0.6～0.8(相当于0.92～1.23 IU木聚糖酶/ml)。取2份0.2 ml的木聚糖酶酶液，一份加入0.2 ml的粗蛋白提取液，另一份加入0.2 ml的0.2 mol/l、pH值7.0磷酸缓冲液，混匀，30℃保温30 min。从保温后的2份混合液中分别取0.1 ml测定其木聚糖酶活力（ODXIP），每个样品设三次重复。以加入缓冲液的反应管中的木聚糖酶活力为对照（OD0）。抑制率（%）=ODXIP/OD0×100。
1.3.5 抑制蛋白与木聚糖酶的抑制比例测定
分别测定抑制蛋白和木聚糖酶的蛋白质含量，再根据各自的相对分子质量换算成摩尔数。设定两者不同的反应比例，对于GH10木聚糖酶，设置抑制蛋白XIP和木聚糖酶的摩尔比分别为0.25∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1、3∶1；对于GH11木聚糖酶，设置抑制蛋白与木聚糖酶的摩尔比依次为0.4∶1、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1；将抑制蛋白与木聚糖酶等体积混合30℃保温30 min之后测定木聚糖酶的残余酶活，对照用等体积的去离子水代替抑制蛋白。
1.3.6 最佳抑制反应时间的测定
将抑制蛋白和木聚糖酶溶液在最适pH值和最适温度下分别反应10、20、30、40、50、60、70 min后，测定木聚糖酶的残余酶活。
1.3.7 最适抑制温度的测定
将抑制蛋白和木聚糖酶溶液等体积混合后，在最适pH值条件下分别在20、30、40、50、60 ℃保温30 min，测定木聚糖酶残余酶活。
1.3.8 最适抑制pH值的测定
将抑制蛋白和木聚糖酶溶液等体积混匀后加入不同pH值的缓冲液（pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），30℃保温30 min，之后测定木聚糖酶的残余酶活。1.3.9 蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶采用12%，浓缩胶采用3%[8]。
2 结果与分析
2.1 毕赤酵母表达XIP型抑制蛋白的SDS-PAGE
将XIP型抑制蛋白的发酵液进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示。通过蛋白迁移率计算其分子量大约为37 kDa，而通过序列计算的理论分子量是30.2 kDa，实际值比理论值多出6.8 kDa，约占理论分子量的2.2%，由此可判断极有可能是毕赤酵母表达系统对抑制蛋白XIP发生了一定程度的糖基化，导致分子量偏高。
图1 重组毕赤酵母表达XIP木聚糖酶抑制蛋白的SDS-PAGE
2.2 XIP型抑制蛋白与木聚糖酶不同摩尔比例对抑制反应的影响
测定抑制蛋白和木聚糖酶的蛋白浓度后，设定两者不同的摩尔比下进行反应，如图2、图3所示。当XIP抑制蛋白对GH10木聚糖酶活性抑制百分比达到50%时，抑制蛋白与GH10木聚糖酶的摩尔比大约为1.2∶1。当XIP抑制蛋白对GH11木聚糖酶活性抑制百分比达到50%时，抑制蛋白与木聚糖酶的摩尔比大约为8∶1。
图2 抑制蛋白与GH10木聚糖酶的摩尔比对XIP抑制蛋白抑制反应的影响
图3 抑制蛋白与GH11木聚糖酶的摩尔比对XIP抑制蛋白抑制反应的影响
2.3 最适抑制温度的测定
在不同的温度下测定XIP抑制蛋白对木聚糖酶的抑制作用，如图4所示。由图4可知，XIP对GH10木聚糖酶和GH11木聚糖酶的最适抑制温度均为40℃，在30～50℃之间，木聚糖酶抑制蛋白的抑制活性较高。
图4 不同温度对XIP抑制蛋白抑制反应的影响
2.4 不同pH值对XIP抑制蛋白和木聚糖酶抑制作用的影响
在不同的pH值下测定其抑制活性，将最高的抑制活性作为100%，测定不同pH值下的抑制率，如图5所示。由图5可知，XIP木聚糖酶抑制蛋白对GH10木聚糖酶和GH11木聚糖酶的最适抑制pH值均为6。在pH值为5～7之间，木聚糖酶抑制蛋白有较高抑制活性。
图5 不同pH值对XIP抑制蛋白抑制反应的影响
2.5 不同反应时间对XIP抑制蛋白和木聚糖酶抑制作用的影响
将抑制蛋白和木聚糖酶溶液混合反应不同时间，测定其抑制活性，并计算抑制率，如图6所示。由图6可知，XIP抑制蛋白与GH10木聚糖酶的抑制作用随时间的延长变化较为平缓，抑制率最大为59.32%，反应10 min时抑制率已达47.57%，随着反应时间的延长，其抑制率变化较为平缓，抑制率最大时的反应时间是50 min。XIP抑制蛋白对GH11木聚糖酶的最佳抑制反应时间约为30 min，30 min后抑制活性基本不再改变。
图6 不同反应时间对XIP抑制蛋白抑制反应的影响
3 结论
本研究发现，XIP抑制蛋白分子量约为37 kDa，高于氨基酸序列计算所得分子量30.2 kDa，可能是由于该蛋白发生了糖基化作用。XIP木聚糖酶抑制蛋白分别作用于黑曲霉GH10木聚糖酶和哈茨木霉GH11木聚糖酶，得到最适抑制比例分别为1.2∶1和8∶1，因此对GH10木聚糖酶具有更强的抑制作用；最适抑制时间分别是50 min和30 min，最适抑制pH值均为6.0，最适作用温度均是40℃。因此为了避免麦类饲料中抑制蛋白对外加木聚糖酶制剂的阻碍作用，饲料中添加GH11木聚糖酶比添加GH10木聚糖酶将会有较小的酶活力损失，有利于发挥木聚糖酶的活性，预计将会更好地解除非淀粉多糖的抗营养作用。
