HuPro蛋白酶在不同蛋白水平罗非鱼饲料中的应用效果研究

■吴建军 王晓亮 周 樱 付大波徐 丽郭 亮刘 伟

(1.武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉 430074；2.农业部淡水生物多样性重点实验室中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北武汉 430223)

酶制剂因其独特的生理功能与作用而被大量用在畜禽饲料中，如饲料添加中性蛋白酶可以提高丝毛乌骨鸡对日粮中氮的利用率及蛋白质类消化酶的活性；而饲料添加蛋白酶可以促进肉仔鸡生长前期的小肠发育以及提高粗蛋白质及大部分氨基酸表观消化率；饲料添加蛋白酶也可以提高肉鸡的蛋白质消化率。但蛋白酶在水产饲料中的应用还很少，目前仅见于鲤鱼、凡纳滨对虾和虹鳟等的报道。而关于吉富罗非鱼饲料蛋白酶的适宜添加量也尚未见报道。吉富罗非鱼（Oreochromis niloticusGIFT）是通过对4个非洲原种品系尼罗罗非鱼和4个亚洲品系尼罗罗非鱼进行种内杂交选育而成的，经过多年选育，其生长速度较其他品系的尼罗罗非鱼品系提高5%～30%，是我国目前罗非鱼养殖中最主要的养殖品系。因此，本研究在罗非鱼饲料中添加HuPro蛋白酶，以探讨HuPro蛋白酶对吉富罗非鱼生长性能和饲料消化率的影响规律，为开发低蛋白罗非鱼饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

试验用吉富罗非鱼来自湖北省罗非鱼原良种场。试验开始前，将试验鱼放置于暂养池暂养1周，以使其适应试验饲料与试验环境。试验鱼分组前，饥饿24 h后，挑选健康且规格大小一致的375尾吉富罗非鱼，平均体质量为（11.90±1.32）g养殖于15个500 L的循环水养殖桶中，每养殖桶25尾鱼，随机分为5组，每种饲料投喂3个养殖桶。

1.2 试验酶制剂

试验用HuPro蛋白酶由武汉新华扬生物股份有限公司提供，添加量为500 mg/kg饲料。

1.3 试验分组与试验饲料

本试验共设5个处理组：高蛋白组（对照组）、中蛋白组(Ⅰ组)、中蛋白+蛋白酶组(Ⅱ组)、低蛋白组(Ⅲ组)、低蛋白+蛋白酶组（Ⅳ组）。试验饲料以鱼粉、豆粕、菜粕、棉粕、面粉等为原料配制，以二氧化钛（TiO2）为指示剂。所有原料粉碎过60目筛，按配方准确称量各种饲料原料，微量组分采用逐级扩大法混合，混合均匀后用小型环模颗粒机压制成粒径为2.0 mm的颗粒饲料，晾干后用封口袋包装备用。饲料配方及营养水平见表1。

表1 试验饲料配方及营养水平（%）

1.4 饲养管理

试验于2014年11月18日至2015年1月23日在中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类营养与饲料研究室的养殖系统中进行，试验期65 d，期间的水温为（25±2）℃，每天投食2次，时间为9：00和16：00，投喂率为鱼体重的4%～5%，每周停食1 d。

1.5 样品采集

1.5.1 粪便收集

正式试验开始后两周，投喂2 h后，等试验鱼排粪便时，用捞网收集水中的粪便，将粪便冷冻后置于真空干燥器中干燥，收集集中，并于4℃冷藏备用。

1.5.2 组织样品采集

试验结束后，停食1 d，每个重复取2尾鱼进行测定体长、体重、肝重和内脏重，并取肠道、胃、肝脏等测定其蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。

1.6 测定指标

1.6.1 生长性能

试验结束时测定鱼的体长、体重、肝重和内脏重，计算相应的指标。

增重率（%）=[（试验末鱼均重-试验初鱼均重）/试验初鱼均重]×100；

特定生长率（%/d）=(ln试验末鱼均重-ln试验初鱼均重)×100/试验天数；

肝体比（%）=肝重/体重×100；

脏体比（%）=内脏重/体重×100；

肥满度（%）=平均体重（g）/[平均体长(cm)]3×100。

1.6.2 饲料效率

统计养殖期间饲料的投喂量及试验鱼的增重量，计算饲料效率。

饲料效率=试验鱼增重量/饲料投喂量。

1.6.3 表观消化率的测定

以TiO2为指示剂，用捞网收集水中的粪便，采用二苯碳酰二肼丙酮法测定TiO2含量，凯氏定氮法测定粗蛋白质含量，计算饲料干物质、粗蛋白质、粗脂肪的表观消化率。

干物质表观消化率（%）=[1-饲料TiO2含量（%）/粪便TiO2含量（%）]×100；

蛋白质表观消化率（%）=（1-饲料中TiO2含量/粪便中TiO2含量×粪便中蛋白质含量/饲料中蛋白质含量）×100。

1.6.4 酶活的测定

每个重复随机取3尾鱼于冰盘中处死，取出全部的肠道，剥除肠道外的脂肪和结缔组织，用冷冻去离子水洗净肠道中的内容物，滤纸吸干水分后，称重。加入10倍冷冻去离子水，于4℃冰浴中匀浆，离心15 min（4℃、12 000 r/min），所得上清液即为消化酶粗酶液。酶液于4℃保存，24 h内检测完毕。

蛋白酶活力测定采用福林酚试剂法，蛋白酶活力单位定义：在30℃，pH值7.5，底物酪蛋白浓度为2%的条件下，1 min内1 g组织中蛋白酶分解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位[μg·Tyr/(min·g)]。

淀粉酶活力测定采用3，5-二硝基水杨酸显色法，淀粉酶活力单位定义：在30℃，pH值7.5，1%的可溶性淀粉作为底物条件下，1 min内1 g组织中的淀粉酶能完全水解淀粉产生1 mg麦芽糖为一个酶活力单位[mg·maltose/(min·g)]。

脂肪酶活性测定采用滴定法，在37℃条件下，每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位（U/g prot.）。

1.7 数据分析

试验结果用“平均数±标准差”表示。数据采用SPSS16.0软件进行ONE-WAY ANOVA分析，并以LSD作多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 饲料中添加HuPro蛋白酶对罗非鱼生长性能的影响（见表2）

表2 HuPro蛋白酶对吉富罗非鱼生长性能的影响

由表2可知，随饲料蛋白质水平的降低，Ⅰ组(中蛋白组)与Ⅲ组(低蛋白组)的增重率和特定生长率与对照组(高蛋白组)相比分别下降了11.94%、33.82%和2.18%、20.52%；添加HuPro蛋白酶后，Ⅱ组(中蛋白+蛋白酶)的增重率和特定生长率较对照组分别提高了0.48%、0.44%，较Ⅰ组提高了14.10%、2.68%，而Ⅳ组(低蛋白+蛋白酶组)的增重率和特定生长率与对照组相比分别低了18.18%、10.04%，较Ⅲ组提高了23.64%、13.18%。

2.2 饲料中添加HuPro蛋白酶对罗非鱼形态指标的影响（见表3）

各试验组肝体比在2.23%～2.65%之间，与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。对照组的脏体比最低，试验各组脏体比均显著高于对照组(P＜0.05)。各试验组间肥满度无显著差异(P＞0.05)。

表3 HuPro蛋白酶对吉富罗非鱼形态指标的影响(%)

2.3 饲料中添加HuPro蛋白酶对罗非鱼消化酶活性的影响（见表4）

由表4可得，与Ⅰ组、Ⅲ组相比，饲料中添加Hu⁃Pro蛋白酶（Ⅱ组、Ⅳ组）后，在不同程度上提高了吉富罗非鱼肝、胃和肠的蛋白酶活性以及胃、肠的淀粉酶和脂肪酶活性，而对肝淀粉酶和脂肪酶活性无显著影响(P＞0.05)。

表4 HuPro蛋白酶对吉富罗非鱼消化酶的影响（U/g）

2.4 饲料中添加HuPro蛋白酶对罗非鱼饲料利用的影响（见表5）

由表5可以看出，与Ⅰ组和Ⅲ组相比，添加Hu⁃Pro蛋白酶的各组提高了营养物质的表观消化率和蛋白质效率，降低了饲料系数。在Ⅰ组29%的蛋白含量的基础饲料中添加HuPro蛋白酶后（Ⅱ组），蛋白质效率、干物质表观消化率、蛋白质表观消化率分别较Ⅰ组提高了11.49%、24.93%、2.86%，较对照组分别提高了8.71%、1.12%、5.39%；饲料系数较Ⅰ组降低了11.04%，较对照组降低了0.68%。在Ⅲ组27%蛋白含量的基础饲料中添加HuPro蛋白酶后（Ⅳ组），蛋白质效率、干物质表观消化率、蛋白质表观消化率分别较Ⅲ组提高了10.95%、4.71%、0.60%，饲料系数降低了15.28%；蛋白质效率、干物质表观消化率较对照组分别降低了7.47%、1.51%，蛋白质表观消化率、饲料系数较对照组提高了8.66%、25.34%。在29%蛋白含量、27%蛋白含量的饲料中，添加HuPro蛋白酶后，每千克鱼饲料成本分别下降了7.03%、15.23%，与对照组相比，Ⅱ组成本也下降了4.99%。

表5 饲料中添加HuPro蛋白酶对罗非鱼饲料利用的影响

3 讨论

3.1 HuPro蛋白酶在不同蛋白水平饲料中的应用效果

一般认为，外源性消化酶，如淀粉酶、蛋白酶等，可以弥补动物消化道内源酶分泌不足，协助内源酶对营养物质进行充分消化，从而提高养分利用率，因此它们在内源酶不易消化的底物越多，如植物性原料，外源性消化酶的作用就越明显。刘鼎云等（2007）在鱼粉含量26.4%的饲料中添加蛋白酶AG 175 mg/kg，提高了凡纳滨对虾幼虾增重率10.8%，而在鱼粉含量33.0%的饲料中添加蛋白酶AG对凡纳滨对虾幼虾生长性能无影响。冷向军等(2008)在鱼粉含量10%、6%的饲料中添加蛋白酶AG后，均显著提高了鲤鱼增重,降低了饲料系数。但在鱼粉含量15%和20%的饲料中添加蛋白酶AG后，对鲤鱼增重率、饲料系数则无显著影响。本试验中，在蛋白含量为27%的基础饲料中添加HuPro蛋白酶后，提高了吉富罗非鱼的增重率和特定生长率。但在蛋白含量为29%的基础饲料中添加HuPro蛋白酶后，虽对吉富罗非鱼的增重率和特定生长率也有一定的提高，但不如蛋白含量27%的基础饲料明显。这表明，在适当的低蛋白含量的饲料中添加HuPro蛋白酶对吉富罗非鱼生长性能的改善作用比较明显。这可能与低蛋白饲料中含有更多的植物蛋白原料有关。植物蛋白质含量高的饲料，尽管其粗蛋白质水平保持不变，但可消化蛋白质降低，氨基酸不平衡且存在多种抗营养因子，添加外源蛋白酶后，加强了植物蛋白的降解，提高了蛋白质和饲料利用效率，因而表现出对生长的改善。可见，在酶制剂的合理应用过程中，必须考虑基础配方的营养组成。

3.2 外源蛋白酶的添加对内源蛋白酶活性的影响

近年来，关于外源蛋白酶对水产动物内源性蛋白酶活性的影响一直备受学者们关注，大量的研究工作被开展，但研究结果不尽一致。本试验中，在蛋白含量为29%的基础料中添加HuPro蛋白酶后，吉富罗非鱼肝、胃、肠中蛋白酶分别提高了18.63%、16.70%、17.48%；在蛋白含量为27%的基础料中添加HuPro蛋白酶，吉富罗非鱼肝、胃、肠中蛋白酶分别提高了35.49%、6.04%、20.10%，这与在奥尼罗非鱼、鲤鱼、虹鳟和黄颡鱼中的研究结果类似。而施培松（2005）在草鱼饲料中添加含N-蛋白酶的复合酶制剂，发现草鱼鱼种摄食后肠道中相同部位（前肠或后肠）的蛋白酶活性无显著影响。王国霞等发现，在南美白对虾基础饲料中添加不同的单酶（分别为淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和蛋白酶）对对虾胃、肠道和肝胰腺的主要消化酶蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均无显著影响。这些研究结果不尽一致，可能与动物(种类、年龄、生理状态等)、饲料组成、环境条件等诸多因素有关，也可能与酶制剂来源、添加的剂量以及本身的一些特性有关。

3.3 HuPro蛋白酶的添加对饲料蛋白质水平的调控作用

一直以来，研究人员都希望在保证动物生长性能不受影响的情况下，适当降低饲料中的蛋白质水平，从而降低饲料成本和减少饲料投喂带来的水体污染。本试验在分别降低2%和4%的蛋白水平下，添加HuPro蛋白酶，试验结果表明，在31%的蛋白水平下，降低2%的蛋白水平，添加HuPro蛋白酶后，对吉富罗非鱼的生长性能没有影响，但是降低4%的蛋白水平，即使添加HuPro蛋白酶也不能弥补蛋白质水平下降对吉富罗非鱼生长性能造成的影响。因此，在通过使用HuPro蛋白酶下调饲料中蛋白质水平时，必须注意蛋白质含量下降幅度不能太大，否则，会影响养殖鱼类的生长。