脓毒症实验动物模型的研究进展

脓毒症实验动物模型的研究进展

郭松喜1王丹2刘春生3

张睢扬1王英1

作者单位： 100000 北京，第二炮兵总医院呼吸科1、药剂科2、骨科3

【关键词】脓毒症;动物模型;微透析技术

脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，尽管近年来抗生素治疗取得了新的进展，但脓毒症病死率仍呈现不断上升的趋势[1]。究其原因是我们仍不能对脓毒症的发生发展有一个准确的监测。制备与脓毒症疾病高拟合度的动物模型至关重要，精准、动态的取样技术与监测方法亦不可或缺，例如微透析(microdialysis, MD)技术[2]。现就近十年来脓毒症动物模型的研究进展做一综述。

一、脓毒症动物模型的基本要求

根据脓毒症的发病因素、病理生理学变化以及临床特征，脓毒症动物模型必须具备以下基本要素：①有脓毒症典型的高排低阻血流动力学表现和高代谢状态；②伴发多个器官功能障碍；③有较高的自然死亡率，根据脓毒症的转归，要求动物模型的自然死亡率达到50%～70%；④脓毒症是严重感染引起机体的炎症反应过度激活造成的自身损伤，不是细菌和内毒素对机体的直接损伤，故出现器官功能障碍及动物死亡距脓毒症模型制备应有一定的时间间距。一般在制模后6～12 h后发生的器官功能障碍或死亡属全身炎症反应所致[3]。

二、常用的脓毒症模型

1.盲肠结扎一穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)： 按预先设计好的严重程度结扎不同位置的盲肠，然后刺穿盲肠(或者用丝线缝穿盲肠并将丝线线圈留置)并将盲肠回纳，连续缝合关腹即可完成CLP模型的制作。CLP脓毒症模型被认为是研究脓毒症潜在机制的理想模型，主要优点之一是能够诱导不同严重程度的脓毒症[4]。脓毒症的严重程度与盲肠结扎长度、穿孔针的大小和穿孔数量等有关。Huber-Lang等[5]使用CLP方法成功制造了脓毒症和脓毒症休克模型，研究发现与单纯的实行CLP操作及单独阻断白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)或者补体C5(complement C5)相比，双阻断CD14和补体C5可以明显提高脓毒症大鼠的生存率，特定的阻断CD14和补体C5或许可以作为治疗脓毒症的一种新策略。Wu等[6]研究发现在CLP组，肝脏及肺泡上皮细胞显示肿胀、变性、坏死及嗜酸性粒细胞浸润，而在人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)组则显示轻度变性及嗜酸性粒细胞浸润，但是没有坏死，这也许是人参皂苷Rb1通过改善动脉血压、下调Toll样受体4信使核糖核酸(Toll-like receptor 4 Messenger RNA，TLR4 mRNA)的表达及阻止肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的生成起到保护脓毒症大鼠的肝脏和肺脏免受损害，提高了其生存率。

2. 腹腔细菌接种: Ahernholz等采用纤维蛋白-粪便凝块，将其种植到腹腔，既能防止粪便中的细菌被过快吸收，又能使细菌持续性释放入血，避免了大量细菌进入腹腔迅速弥散而产生中毒性休克。这种方法制作的模型虽然可产生类似脓毒症患者的细胞因子反应，但很少发生器官功能障碍和血液动力学改变。为此，有人在纤维蛋白-粪便凝块模型的基础上，增加肠道缺血—再灌注进行二次打击，制作严重脓毒症和器官损害模型。杨景程等[7]通过在腹腔注射热灭活细菌菌液制造小鼠脓毒症模型，实验观察了中药活性成分苦柯胺B(kukoamine B, KB)体内外拮抗脓毒症的药理活性，得出苦柯胺B作为一种多病原分子的中和剂，能够抑制炎症介质的释放，发挥对脓毒症模型小鼠的保护作用，且效果显著优于现有临床用药血必净和乌司他丁。

3. 腹腔注射人粪便悬液: Connert等[8]改良了人粪便悬液腹腔注射法。收集并混合健康非素食人的粪便，迅速将其与预先配置的巯基乙酸盐悬液按1︰1体积稀释以优化细菌生长，加入过氧化氢酶( 0.19 mg/100 ml) 以灭活活性氧。悬液中加入10%甘油，厌氧条件下匀浆。然后将处理好的人粪便悬液按实验目的经大鼠右下腹腹腔注射。Swarbreck等[9]通过腹腔注射人粪便悬液建立了脓毒症小鼠模型，研究发现脓毒症了增加所有体液和器官中细菌的含量、纤溶酶原激活剂抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)的信使核糖核酸含量以及肺和肝中的酶活性。脓毒症可增加肺及肝中髓过氧化物酶的水平，但在脾中却降低。因此，抗坏血酸盐对脓毒症小鼠骨骼肌毛细血管堵塞的快速反应并不伴随着PAI-1改变或髓过氧化物酶反应而发生。

4. 细菌或内毒素血症模型: 脓毒症是细菌及其细胞壁主要成分—脂多糖(lipopoly saccharide, LPS)释放入血导致的全身炎症反应。理论上，静脉注射细菌或LPS能引起机体炎症介质释放，模拟急性全身炎症反应的症状。根据输注细菌或加内毒素的速度和量可以分为3种：大剂量单次输注、小剂量单次输注和小剂量持续输注。小剂量单次输注所制作的模型器官功能损害可能不明显，死亡率低，不符合脓毒症的预后规律。同单次输注致死量(大剂量单次输注)的模型相比，持续小剂量注射法模型的促炎细胞因子肿瘤坏死因子呈低水平升高，但维持时间长，动物长时间地呈现高排低阻的血液动力学变化和高代谢状态，与脓毒症患者的病理生理和临床表现较为相似。陈明祺等[10]通过持续小剂量静脉注射脂多糖(LPS，5 mg/kg)建立脓毒症模型，研究了脓毒症小鼠的炎症反应及免疫功能。病理切片表明在LPS输注2 h后模型组及四逆汤组均出现肠黏膜中炎症细胞严重浸润，绒毛严重破坏，而12 h后四逆汤组较模型组炎症细胞浸润有所减轻，肠绒毛的修复亦较明显。得出四逆汤可以调节全身炎症反应系统，促进脓毒症小鼠的肠黏膜、肠道功能及免疫状态的修复。Skorup等[11]通过持续小剂量静脉注射大肠杆菌建立了猪的脓毒症模型，研究表明对于革兰阴性菌感染的严重脓毒症或脓毒症休克的早期阶段，在内酰胺类抗生素的基础上联合一种氨基糖苷类抗生素能增强抗菌作用。

5. 烧伤脓毒症: 烧伤脓毒症及其诱发的脓毒性休克和多器官功能障碍综合征，已成为烧伤患者死亡的主要原因之一，因此，脓毒症的早期诊断对其治疗有重要意义。Shi等[12]制造了烧伤加绿脓杆菌感染的脓毒症模型，得出银耳多糖可以抑制烧伤加绿脓杆菌感染的脓毒症小鼠CD4(+)CD25高表达调节细胞的异常活动，至少可以减少白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)的分泌，并能够激发活化的 CD4(+)T 细胞Th2向Th1的转变。此外，银耳多糖能明显降低烧伤脓毒症小鼠的死亡率。

6. 腹膜炎脓毒症: Melo等[13]通过向小鼠腹腔注射粪便制造了自发性腹膜炎，并观察了腹膜炎进展至脓毒症的过程，得出对于没有永久双边颈动脉闭塞(permanent bilateral carotid occlusion, PBCO)的年幼大鼠，静脉注射莫西沙星及地塞米松治疗严重粪便腹膜炎是非常有效的，对于合并有PBCO，甚至是腹腔和胸腔有残存脓肿的老年大鼠亦能达到一定的效果。陈海鸣等[14]通过升结肠支架置入制造了腹膜炎模型，得出其操作简单，具有可重复性，可以模仿人类弥漫性腹膜炎疾病过程，适用于外科脓毒症的研究。并且升结肠支架置入腹膜炎模型可以模拟临床上患者肠瘘的病理生理变化，由早期出现的体温下降，白细胞及炎症因子增高及菌血症反应，最终引起致死性脓毒症反应。

7. 其他: 脓毒症常见靶部位有肺、肾、骨髓、血液系统、泌尿系统、胆道系统等，根据实验目的还有很多制造脓毒症的方法，例如：Maybauer等[15]在气管切开造口处灌输铜绿假单胞菌制造了羊严重脓毒症模型，研究了选择性血管加压素1型受体激动剂对严重脓毒症的作用，得出脓毒症复苏时使用选择性抗利尿激素1a型受体激动剂比1a型受体激动剂和V2型受体激动剂的混合剂能更有效防止血管阻塞。Hestenes等[16]在完成内侧胸骨切开术后，向其内注射了大肠杆菌，建立了猪脓毒症模型，探讨了严重脓毒症的心肌功能障碍，研究表明张力超声心动图可以在射血分数和心输出量显著变化之前反映心肌功能障碍，其有望成为临床评估脓毒症的一项有用工具。

三、脓毒症动物模型评价指标

1. 脓毒症成模标准: 动物出现发热，心率、呼吸频率明显加快，口鼻腔分泌物增多，精神萎靡，嗜睡，蜷缩，竖毛，少动，拒食或少食，眼角出现分泌物，血培养阳性等为模型成功。脓毒症标准加上至少一个器官功能障碍为严重脓毒症成模标准。

2. 监测指标

(1)血标本检测：

① C-反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)：对于脓毒症的早期诊断及预后评估有重要价值。Park等[17]研究发现对于伴有肾功能损伤的脓毒症患者，CRP可作为一个准确的感染指标。虽然检测降钙素原(procalcitionin, PCT)的花费要比CRP高，但是作为炎症指标，PCT的诊断价值并不优于CRP。Alkhamis等[18]发现术前CRP水平是预测肿瘤患者发生脓毒症的一个可靠指标。

② 血清PCT：可作为早期鉴别全身感染及判断脓毒血症严重程度及预后的有效指标。研究表明，PCT诊断脓毒症有较好的敏感性和特异性，PCT<5.0 ng/ml对于脓毒症有足够的排除标准[19]。血浆中PCT浓度的升高不仅可以判断是否存在全身细菌感染，而且可以反映感染的严重程度。Huang等[20]发现，PCT≥10.0 mg/L时，致病菌为革兰阴性菌的几率比革兰阳性菌的几率大。虽然血清PCT和CRP水平均可用于细菌性脓毒症的诊断和预后评估，但血清PCT的敏感性和特异性比血清CRP更好。

③ 乳酸：是诊断脓毒症的有效指标。紧急情况下乳酸水平可为心血管意外和组织低灌注提供早期线索，除了评估血清电解质，血气分析亦有助于危重患者的临床评估和管理[21]。

(2) 微透析技术(MD)检测：微透析技术可用于测定人体组织间液中的小分子和大分子物质。Ditz等[22]发现脓毒症小鼠组织间质中乳酸及甘油水平、肌肉组织中乳酸/丙酮酸比值及乳酸/葡萄糖比值均会明显增高。Nikitas 等[23]通过微透析技术研究发现即使在血乳酸水平正常(<2 mmol/L)的患者，脂肪组织中乳酸/丙酮酸比值的变化趋势仍有明显统计学意义。死亡患者脂肪组织中乳酸/丙酮酸比值明显高于幸存者，差异有统计学意义。

(3) 尿液标本检测：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是一种分泌性蛋白。NGAL可作为早期预测及评价脓毒症伴有急性肾损伤的一个独立生物学标记[24]。研究表明NGAL在正常肾组织中呈低水平表达，但在肾缺血/再灌注损伤和顺铂诱导小鼠肾损伤模型中，损伤后3 h时的尿液中即可检测到NGAL，明显早于尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-glucosaminase，NAG)、β2-微球蛋白、及血清肌酐(serum creatinine, SCr)的改变，是目前基础实验中经常选用的评价急性肾损伤的指标[25]。

四、展望

尽管上述各种脓毒症模型存在诸多局限，也没有一种脓毒症模型能完全再现脓毒症的演变过程，但是脓毒症模型对脓毒症研究领域仍有不可替代的作用。根据实验需要，制作不同的符合要求的脓毒症模型，是研究脓毒症的必不可少的一种手段。MD技术已被确立为一种可靠的体内工具，具有在体、实时、在线取样等优势，可精确检测脓毒症能量代谢产物乳酸、丙酮酸等。随着MD技术在脓毒症研究中的成熟，有望应用MD技术准确监测脓毒症演变过程，不断完善脓毒症动物模型的制备，为脓毒症疾病的研究，诊治提供支持。

参考文献

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(本文编辑：张大春)

郭松喜，王丹，王英，等. 脓毒症实验动物模型的研究进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(5)： 635-637.

·综述·

收稿日期：(2015-01-22)

文献标识码：中图法分类号： R563 A

通讯作者：王英，Email：lilywang0701@sina.cn

基金项目：国家自然科学基金(81301662)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.025