microRNA参与急性肾损伤的研究进展

·综述·

microRNA参与急性肾损伤的研究进展

吴声丁小强方艺

Research Development of MicroRNA Involving in Acute Kidney InjuryWUShengDINGXiaoqiangFANGYi

DepartmentofNephrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一种涉及多学科的临床常见危重病症。AKI的发病率在综合性医院为5%～15%，在重症监护病房则达30%～60%[1-3]。2004—2008年176 155例住院患者的流行病学研究数据[4]显示，住院患者AKI发病率为3.19%，病死率为19.68%，经校正后AKI患者对所有患者住院病死率的比值比(OR)为9.86。尽管近年来血液净化技术已有长足进步，但AKI患者的死亡率仍居高不下，重要原因之一是缺乏有效的早期诊断和防治手段。目前临床上常用的肾功能指标，例如血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine, Cr)等在肾脏损伤早期缺乏敏感性和特异性。因此，目前AKI防治的基础研究主要集中于：(1)寻找新的、更为敏感的早期诊断的新标志物；(2)探索AKI治疗的分子靶点和特异信号途径。近年来研究证实，微小RNA(microRNA, miRNA)广泛参与细胞增生、凋亡、免疫炎性反应等多种机体生物学过程的调控，在AKI的发病中也起着至关重要的作用。

1miRNA概述

miRNA是一类由21～ 25个核苷酸组成的内源性非蛋白质编码的RNA序列，它们参与的基因调控是遗传程序中最基本的一步。miRNA能在转录后水平调控基因的表达，其通过与靶基因 mRNAs 的3′非翻译区(untranslating region，UTR)完全或不完全互补结合，降解靶基因mRNAs或抑制其翻译，从而有效抑制相关蛋白的合成[5-6]。人类编码蛋白的基因中至少有1/3受到 miRNA的调控；而在单个基因的3′UTR中也发现能与多个 miRNAs互补的位点，提示miRNA组合调控模式十分复杂。miRNA既扮演着“管理员”的角色，使生命活动有条不紊地进行，又是决定某些关键事件的分子开关，并能有效沉默机体所不需要的靶基因，广泛涉及细胞的分化、增殖、代谢和凋亡等。miRNA在个体发育和一些疾病尤其是肿瘤发生中的作用越来越受到关注，并已成为治疗研究的重要靶点。miRNA在肾脏中作用的报道始于2004年。之后的多项研究表明，miRNA在肾脏的发育及生理、病理过程中也起了重要作用。

miRNA的成熟过程包括若干步骤。首先，miRNA基因翻译后的初级产物——pri-miRNA在细胞核内经核糖核酸酶Drosha加工，形成具有茎-环结构的pre-miRNA；然后，pre-miRNA进入胞质，被Dicer酶加工成双链RNA(miRNA：miRNA*)，其中一条链被降解，而另一条链则与RNA诱导沉默体(RISC)相整合后进行靶基因调控[7-8]。

随着对miRNA研究的深入，学者们发现，miRNA不仅能稳定地在组织或细胞中表达，同时也能以一种稳定的、游离的状态存在于各种体液中，包括尿液、血液、唾液和乳汁等。这类游离的miRNA的来源和存在形式目前尚未明了，但是一般认为有三种可能：(1)来自组织损伤，当细胞发生凋亡或坏死时，细胞结构破坏，导致细胞内的miRNA被动释放；(2)来自微泡(microvesicle，MV)的主动分泌，微泡是正常或病理的情况下各类细胞释放出的膜封闭的细胞碎片，如外泌体和囊泡；(3)miRNA 结合蛋白途径，循环中的miRNAs可以与HDL(high-density lipoprotein)，AGO-2(argonaute-2)，NPM-1(nucleophosmin-1)蛋白相结合，从而不被RNA酶降解。此外，尽管miRNA的分子量很小，但在透析时不会被透析膜清除，这也证实了miRNA在血液中与大分子物质相结合且稳定存在[9]。因此，miRNAs可能因其易获得性和稳定性而成为一种潜在的AKI防治靶点或早期诊断的生物标志物。

2miRNA与肾脏缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury, IRI)的关系

IRI是AKI发生的重要机制。Dicer在miRNA成熟过程中起重要作用。研究[10]通过敲除C57BL/6小鼠肾脏近曲小管上皮细胞的Dicer基因(PT Dicer-/-)，探究肾小管上皮细胞miRNA与IRI的关系。结果表明，小鼠近曲小管上皮细胞PT Dicer-/-不影响肾脏的发育和生理功能，然而发生双侧肾脏IRI后，与对照组相比，PT Dicer-/-小鼠更耐受IRI，肾脏病理损伤程度轻，存活率更高。同时，该研究比较了两组小鼠肾皮质miRNAs的表达丰度， miRNA微阵列芯片分析结果显示，标记的173种miRNAs中有139种(80.3%)的表达丰度在PT Dicer-/-组显著下调，包括在正常肾组织富集的miR-192、miR-194以及在多种脏器中高表达的miR-16，提示miRNA参与IRI过程。随后，Godwin等[11]在单侧肾脏IRI小鼠模型中发现，缺血肾组织中有9种miRNAs(miR-21、miR-20a、miR-146a、miR-199a-3p、miR-214、miR-192、miR-187、miR-805、miR-194)的表达丰度发生显著变化。其中，miR-21和miR-20a在缺血再灌注后立即上调；miR-146a、miR-199a-3p、miR-214在缺血再灌注3 d后上调，其中前两者的表达丰度在观察期间保持上调，而miR-214则在缺血再灌注第21天开始衰减；miR-192和miR-187 在对照组中较基线值表达上调并保持平稳，而在IRI组中丰度持续下降；IRI组小鼠肾组织的miR-805 和miR-194的表达丰度虽然下降，但与对照组的表达趋势相似。Godwin等同时对NK细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞功能缺失的R0/cg0双基因敲除小鼠施以相同的缺血再灌注打击，所获得的肾脏miRNA的指纹图谱与野生型小鼠相似。由此证明，缺血再灌注时miRNA的这些变化与免疫炎性反应无关，是IRI特有的指纹图谱。

有多项研究报道了单个miRNA在肾损伤过程中的作用。研究[12]发现，miR-494的靶基因之一是激活转录因子-3(activating transcription factor-3，ATF-3)；上调miR-494可抑制ATF-3表达，进而通过NF-κB途径调节炎性因子和黏附分子的释放，促进炎性反应，从而加重IRI。该研究还发现，尽管血浆miR-494水平与AKI发病无关，但是尿液miR-494丰度与AKI的发生呈正相关，且尿液miR-494的表达变化早于血肌酐变化。

低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF) 在肾脏对缺血/缺氧的反应调节中起重要作用。作为维持氧自稳平衡的核心调控因子，HIF调控多种低氧应答基因的表达。这些基因产物或能增加缺氧组织的氧供和氧运输能力，或能降低细胞耗氧量，从而缓解氧供需失衡，维持内环境的稳定，使机体对缺血缺氧耐受和适应。Aguado-Fraile等[13]研究发现，低氧刺激诱导HIF-1α上调后，miR-127的表达上调；而体外细胞实验证实，过表达miR-127可改善近曲小管上皮细胞由低氧刺激所致的骨架结构和细胞黏附功能的异常，表现为黏着斑复合物(focal adhesion complexes，FAC)分解、紧密连接破坏以及肌动蛋白解聚等现象被逆转。已证实miR-127的靶基因是驱动蛋白家族成员3B(kinesin family member 3B，KIF3B)，后者参与肾小管上皮细胞内吞和微管转运运输，且其表达与miR-127的表达呈负相关。miR-127上调能通过下调KIF3B而介导离子转运的正确定位，减少近曲小管细胞的内吞，减少能量损耗，起到对肾组织的保护作用。由此可见，miR-127在肾损伤中起重要作用，也可以作为AKI潜在的生物学标志物和治疗靶点。

3miRNA与肾毒性物质所致AKI的关系

药物是导致AKI的重要因素之一，包括氨基糖苷类氨基酸和抗肿瘤药物等。顺铂是治疗肿瘤最常见和最有效的药物之一，其主要的不良反应是肾毒性，发生率为25%～35%。顺铂通过ATR-Chk2信号途径激活p53，进而破坏肾小管上皮细胞的DNA结构，导致细胞损伤和死亡。然而，p53的作用具有两面性，它既参与肾小管上皮细胞损伤，也可以通过上调miR-34a发挥一定的肾脏保护作用。体内外实验[14]证实，顺铂可以诱导肾小管上皮细胞miR-34a水平上调，而在应用p53抑制剂或在p53基因敲除的小鼠模型中，顺铂对miR-34a的上调作用消失，可见p53介导了顺铂诱导的miR-34a表达上调；另一方面，采用anti-miR-34a抑制肾小管上皮细胞中的miR-34a表达可促进细胞凋亡，反之，促进miR-34a过表达可减少细胞坏死、增加细胞活力，提示miR-34a在顺铂诱导的AKI中起保护作用。

4miRNAs与缺血预适应的关系

缺血/缺氧引起器官损伤取决于两个方面，即缺血/缺氧的程度和器官对缺血/缺氧的耐受程度。如果器官对缺血/缺氧耐受，则不会发生损伤或损伤的程度较轻。短时间的缺血预处理能显著减轻器官后续严重缺血引起的损伤，这种机体的自我保护现象称为缺血耐受或缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC)，是迄今为止发现的最强有力的预防缺血性器官损伤的内源性措施。IPC最早是在有关心和脑的研究中被提出，之后的研究(包括我们科室近十余年的研究)均证实肾脏IPC可以减轻二次缺血打击对肾脏的损伤。因此，诱导缺血/缺氧耐受可有效防治急性缺血性肾损伤。

我们的研究[15]证明，15 min的肾脏缺血处理可以使肾脏耐受后续的缺血打击，并减轻IRI的程度；预缺血的肾保护作用与肾组织miR-21的表达上调相关，而miR-21的上调可抑制程序性细胞凋亡因子4(programmed cell death protein 4,PDCD-4)的表达，减少细胞死亡，进而预防或减轻肾脏缺血损伤程度。而miR-21的上调依赖于HIF-1α的表达上调，如采用HIF-1α decoy技术抑制HIF表达，则可抑制miR-21的表达。在成功建立肾脏缺血预实验动物模型的基础上，我们还建立了不同策略诱导的肾脏缺血/缺氧耐受模型。我们近期的研究[16]发现，氙气预处理也可保护对IRI的保护作用肾脏。经氙气预处理过的小鼠在遭受缺血刺激时，肾小管细胞的损伤减轻；同时发现，氙气预处理后，miR-21表达上调，如采用anti-miR-21抑制肾组织miR-21表达，则氙气的保护作用减弱，提示miR-21在氙气预处理IRI中起着重要作用。此外，我们在氨基糖苷类诱导的肾毒性动物模型中也证实，氙气预处理通过上调miR-21丰度而减轻肾毒性[17]。可见，无论是在预缺血处理还是氙气诱导的缺氧耐受中，miR-21都发挥了关键的作用。

5分泌型miRNA

分泌型miRNA以微泡形式或与蛋白质结合的形式稳定存在于体液中。与其他以游离形式存在的miRNA最主要的区别在于，分泌型miRNA是细胞主动耗能分泌的。它可以作为细胞间联系的一种重要分子，广泛存在于各种细胞内，其生物学作用不受细胞间距离的影响，且供者细胞分泌的miRNA能够影响受者细胞的基因表达[18]。

由内皮干细胞(EPC)主动分泌的富含miRNA的微泡在缺血再灌注时能保护受损器官，减轻IRI。德国学者Cantaluppi等[19]采用微阵列技术对EPC和EPC分泌微泡进行了分析，发现有131种miRNA为两者共有，另有26种miRNA仅富集于微泡中，其中包括促进血管新生的miR-126和抑制凋亡的miR-296。在体内试验中，将从外周血EPC中分离的微泡从尾静脉及时注入发生缺血损伤的大鼠体内后可以促进肾小管上皮细胞增生，减少上皮细胞凋亡，减少白细胞浸润；而用RNase处理、敲除Dicer基因或用anti-miR-126﹑anti-miR-296处理EPC后，这种保护作用消失。因此认为，分泌型miRNA对AKI起保护作用。

分泌型miRNA不仅可以在AKI中起保护作用，而且因其具有结构稳定、不易受尿液因素影响、变化出现早、可无创性获得等优点，还可以作为AKI的特异性生物标志物。miR-21不仅在肾组织中条件性高表达，而且当肾脏遭遇缺血损伤时，其在体液(尿液和血液)中呈时序性变化。临床研究[20]显示，血浆和尿液中的miR-21的丰度与心脏术后AKI的进展程度及患者预后相关，因此，miR-21可能作为AKI早期诊断和预后预测的新的生物标志物。Lorenzen等[21]研究了77例AKI患者血浆miRNAs的指纹图谱，发现接受肾脏替代治疗的AKI危重患者的血浆miR-210上调，多变量Cox比例风险回归分析和Kaplan-Meier曲线分析均证明血浆miR-210是患者28 d存活率的独立预测因子。动物实验[22]发现，miR-10a 和 miR-30d是富集于肾脏的miRNA。小鼠发生AKI时，尽管血浆中的miR-10a 和 miR-30d丰度变化不大，但尿液miR-10a 和 miR-30d丰度显著增加，且其含量与肾损伤的程度呈正相关。与AKI的其他生物标志物相比，分泌型miRNA具有稳定、不受尿液性状影响、敏感性高的优势，可能是更为理想的AKI生物标志物。

6总结

miRNA广泛涉及细胞最基本的生命活动过程，如分化、增殖、代谢和凋亡等，在疾病中的作用越来越受到关注，并已成为肾脏疾病治疗研究的重要靶点，也是AKI研究的热点。miRNA通过多种机制参与不同病因所导致的AKI发病，是AKI发病的重要调控因子，且是AKI早期诊断和预后预测的生物标志物。但是，miRNAs作为AKI生物标志物的临床应用和推广目前仍有一些问题：(1)miRNAs能否反映肾组织细胞是亚致死性损伤、凋亡或坏死；(2)miRNAs能否动态反映肾损伤的演变过程(是在加重还是逐步恢复)；(3)miRNAs能否用于病因的诊断，是单纯缺血，还是药物、毒素所致；(4)miRNAs用于检测AKI的可行性和经济效益如何。相信随着技术的发展和相关研究的深入，上述质疑都能得到解决。

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中图分类号(复旦大学附属中山医院肾内科，上海200032)R692

文献标识码A

通讯作者方艺，E-mail:fang.yi@zs-hospital.sh.cn

基金项目：国家自然科学基金(编号：81200557)；上海市卫生局科研计划课题资助项目(编号：20114275)