上调miR-519d对喉鳞癌细胞增殖及凋亡的影响

沈纳　白广平　高天乐　黄新生　李俊

(1. 复旦大学附属中山医院耳鼻咽喉科，上海　200032；

2. 复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻咽喉科，上海　201700)

·论著·

上调miR-519d对喉鳞癌细胞增殖及凋亡的影响

沈纳1白广平2高天乐2黄新生1李俊2

(1. 复旦大学附属中山医院耳鼻咽喉科，上海200032；

2. 复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻咽喉科，上海201700)

摘要目的：研究miR-519d对喉鳞癌细胞增殖及凋亡的调控作用。方法： 采用RT-PCR、Western印迹等技术检测人喉癌上皮细胞株Hep-2及人支气管上皮细胞(human bronchial epithelium cell，HBE)中信号转导和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)以及miR-519d的表达情况；通过质粒转染上调Hep-2细胞株中miR-519d的表达后，采用细胞增殖及凋亡检测技术观察转染细胞与对照细胞的增殖及凋亡情况。结果： STAT3 mRNA在Hep-2中的表达明显高于其在HBE细胞中的表达(P<0.05)，而miR-519d在Hep-2中的表达明显低于其在HBE中的表达(P<0.05)。STAT3在转染miR-519d后的Hep-2细胞中的表达明显下降(P<0.05)。转染后继续培养0～7 d，转染后Hep-2细胞的增殖率明显低于未转染细胞(P<0.05)。 转染后继续培养24 h，转染miR-519d的细胞凋亡率为(2.80±0.15)%，对照细胞的凋亡率为(0.92±0.09)% (P=0.000 4)。转染后继续培养72 h, 转染miR-519d的细胞凋亡率为(23.06±3.52)%，对照细胞的凋亡率为 (23.26±2.56)%(P=0.965 5)。结论： STAT3在Hep-2细胞中高表达，而相关的miR-519d呈低表达，通过上调miR-519d可以抑制STAT3的表达从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。

关键词喉鳞癌；miRNA-519d；STAT3； 增殖；凋亡

中图分类号R739.65

文献标识码A

Effect of Up-Regulating miR-519d on Proliferation and Apoptosis of Laryngeal Squamous Cell CarcinomaSHENNa1BAIGuangping2GAOTianle2HUANGXinsheng1LIJun2

1.DepartmentofOtolaryngology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofOtolaryngology,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China

AbstractObjective： To investigate the effect of up-regulating miR-519d on proliferation and apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma. Methods： The expression of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and miR-519d in human laryngeal carcinoma epithelium cell line Hep-2 and human bronchial epithelium cell(HBE) were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting. After up-regulating miR-519d expression in Hep-2 cell line by plasmid transfection technique, the proliferation and apoptosis of transfected cells and control cells was detected by proliferation and apoptosis assays. Results： STAT3 mRNA expression in Hep-2 cells was significantly higher than that in HBE cells (P<0.05). However, miR-519d expression in Hep-2 cells was significantly lower than that in HBE cells (P<0.05). The STAT3 mRNA expression in the transfected Hep-2 cells decreased significantly. During 0 and 7 day of post-transfection culture, proliferation rate of transfected Hep-2 cells was significantly lower than that of untransfected cells (P<0.05). After 24 h culture, the apoptosis rate of miR-519d transfected cells was (2.8±0.15)%, while that of control cells was (0.92±0.09)% (P=0.000 4). After 72 h culture, the apoptosis rate of miR-519d transfected cells was (23.06±3.52)%, while that of control cells was (23.26±2.56)% (P=0.965 5). Conclusions： STAT3 shows high expression in Hep-2 cell, while the related miR-519d shows low expression. By up-regulating miR-519d, STAT3 expression could be suppressed, so as to suppress the proliferation of tumor cells and promote the apoptosis of tumor cells.

Key WordsLaryngeal squamous cell carcinoma;miRNA-519d;Signal transducer and activator of transcription 3;Proliferation;Apoptosis

喉癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%，近年来其发病率明显增长。喉癌中93%～99%为喉鳞状细胞癌。目前对喉癌特别是晚期喉癌尚无满意的治疗方法[1]。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是基因表达的重要调控因子。研究[2]显示，许多miRNAs的功能与细胞增殖、分化和凋亡等有关；miRNAs直接或间接导致了肿瘤的发生，是肿瘤治疗研究的潜在靶点。我们在以往研究的基础上，采用生物信息学软件(TargetScan)对特异性miRNAs进行靶基因预测筛选，发现喉癌的多个特异性miRNAs有一个共同的靶基因—信号转导和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)。通过调控STAT3，特异性的miRNAs可能在喉癌的发生发展中发挥重要作用。研究喉癌中特异性的miRNAs对STAT3的作用及其调控机制意义重大。

1资料与方法

1.1细胞株和试剂喉癌细胞株Hep-2、人支气管上皮细胞株(human bronchial epithelium cell, HBE)购自中国质粒载体细胞基因保藏中心。转染试剂LipofectaminTM2000购自美国Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培养液购自美国Gibco公司。PCR试剂盒购自美国LifeScience公司，Western印迹试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所。引物设计由上海杏园生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1引物序列设计采用在线设计软件设计STAT3的RT-PCR引物序列，上游引物：5′-GGCCCAATGGAATCAGCTACAG-3′，下游引物：5′-GAAGAAACTGCTTGATTCTTCG-3′。hsa-miR-519d成熟体序列：CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG；寡聚单链DNA序列设计：5′-TGCTGCAAAGT-GCCTCCCTTTAGAGTGGTTTTGGCCACTGA-CTGACCACTCTAAGGAGGCACTTT-3′、5′-CC-TGAAAGTGCCTCCTTAGAGTGGTCAGTCAG-TGGCCAAAACCACTCTAAAGGGAGGCACTT-TGC-3′。

1.2.2Hep-2、HBE细胞培养及STAT3和miR-519d表达检测使用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM(含1.5 mmol/LL-谷胺酸、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素)于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养细胞。采用RT-PCR法和Western印迹法检测Hep-2、HBE细胞中STAT3的表达情况，以RT-PCR法检测miR-519d的表达情况。

1.2.3Hep-2细胞转染及表达检测在1.5 mL EP管中加入75 μL(25 μL/孔×3孔)Opti-MEM I，再加入不同剂量的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-negative，混匀；取另一1.5 mL EP管，加入75 μL(25 μL/孔×3孔)Opti-MEM I，加入相应剂量的LipofectaminTM2000，混匀；室温放置5 min后将两管混合，室温放置20～30 min。将转染混合物加入含50 μL无血清DMEM的事先铺上细胞的96孔板中，混匀后，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中温育4～6 h。吸去转染液，用D-Hank’s solution漂洗后，加入DMEM完全培养基，37℃培养24 h。采用RT-PCR和Western印迹检测miR-519d及STAT3的表达。

1.2.4Hep-2细胞转染后细胞增殖实验细胞培养过夜后，倾去培养液，用3 mL D-Hank’s solution洗涤细胞两次。加1 mL Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3～5 min。加入 6 mL 含10% FBS的培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。用血球计数板计数后将细胞稀释至3×105细胞/mL。按2.5×103细胞/孔的密度接种96孔板，同时设置对照组，即直接在孔中加入100 μL DMEM培养基；每组设7重复，于37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。转染后0～7 d，将相应孔吸去培养液，加入新鲜的培养基100 μL，每孔避光加入CCK8 10 μL，避光培养1～4 h后，用酶标仪于490 nm波长处测光密度(D)值。

1.2.5细胞凋亡实验用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细胞。后用400 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，密度大约为1×106细胞/mL。在细胞悬浮液中加入5×Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2～8℃ 避光条件下孵育15 min。加入10×PI 后轻轻混匀于2～8℃，避光条件下孵育5 min。在 1 h 内用流式细胞仪检测。

2结果

2.1STAT3和miR-519d在HBE及Hep-2细胞中的表达情况

2.1.1RT-PCR结果STAT3在Hep-2中的mRNA表达水平明显高于其在HBE中的表达(P<0.05，表1、图1A)，而miR-519d在Hep-2中的表达水平明显低于其在HBE中的表达(P<0.05，表2、图1B)。

A： STAT3在Hep-2中mRNA的表达明显高于在HBE中的表达(*P<0.05); B: miR-519d在Hep-2中的表达明显低于HBE中的表达(*P<0.05); C: STAT3在转染后的细胞中的表达明显下降(*P<0.05); D: 转染后 miR-519d在转染细胞中的表达明显高于对照细胞(*P<0.05); E: Western印迹的灰度值证实了STAT3在Hep-2细胞中的高表达; F: Western印迹的灰度值证实了上调miR-519d可以抑制STAT3的表达

图1　HBE、Hep-2细胞中STAT3及miR-519d的表达

2.1.2Western印迹检测实验STAT3在Hep-2中的蛋白表达水平明显高于其在HBE中的表达(P<0.05，表3、图1E)。

2.2miR-519d 转染Hep-2细胞的转染效率及其对STAT3的调控作用miR-519d在转染细胞及对照细胞中的表达通过qRT-PCR检测，而STAT3在转染细胞和对照细胞的表达通过qRT-PCR 和 Western印迹检测。结果显示，转染后 miR-519d在转染细胞中的表达明显高于对照组(图1D，P<0.05)，STAT3在转染后的细胞中的表达明显下降(表4，图1C、1F，P<0.05)。

2.3上调miR-519d可以抑制Hep-2细胞的增殖在转染后我们对miR-519d转染的Hep-2细胞和未转染的对照细胞进行细胞增殖实验。我们观察到，在转染后继续培养0～7 d，转染细胞的增殖率明显低于未转染细胞(图2,P<0.05)。

2.4上调miR-519d可促进Hep-2细胞的早期凋亡在转染后继续培养24 h，转染miR-519d的细胞凋亡率为 (2.8±0.15)%，对照细胞的凋亡率为(0.92±0.09)% (P=0.000 4)。继续培养72 h, 转染miR-519d的细胞凋亡率为(23.06±3.52)%，对照细胞的凋亡率为(23.26±2.56)% (P=0.965 5)。见图3。

A、B: 培养24 h后流式细胞仪检测转染细胞和对照细胞凋亡率所得的结果； C、D: 培养72 h后流式细胞仪检测转染细胞和对照细胞凋亡率所得的结果； E: 24 h时转染细胞的凋亡率高于对照组(*P<0.05)，而72 h时两者的凋亡率无明显差别(P>0.05)

图3上调miR-519d对Hep-2细胞凋亡的影响

3讨论

STAT3目前已被定义为癌基因，它是肿瘤信号转导的研究热点，许多癌组织和源于肿瘤的癌细胞株均有STAT3的表达[3]。王俊阁等[4]用免疫组织化学法检测50例喉癌标本和10例癌旁正常组织标本时，发现STAT3及磷酸化STAT3在癌组织中高表达，而癌旁组织为阴性。钟刚等[5]和张寒冰等[6]通过RT-PCR检测发现：与对照组正常癌旁组织相比，STAT3在喉癌中表达增高(P<0.05)，STAT3的过量表达可能在喉癌的发生、发展中起重要作用。文献[5]发现STAT3活性增高是喉癌的早期事件，阻断STAT3表达有可能抑制喉癌的发展。本研究发现STAT3 在Hep-2细胞中的表达明显高于正常气管黏膜上皮细胞(P<0.05)。

同时我们在以往研究的基础上，通过生物信息学软件(TargetScan)在对特异性miRNAs进行靶基因预测筛选时，发现喉癌的多个特异性miRNAs有一个共同的靶基因——STAT3。通过调控STAT3，特异性的miRNAs可能在喉癌的发生发展中发挥十分重要的作用。因此，本研究选取miR-519d这个特异性miRNA进行研究，以探讨其对STAT3的调控作用，观察其对肿瘤增殖及凋亡的作用。本研究表明，在Hep-2细胞中miR-519d的表达明显低于正常气管黏膜上皮细胞(P<0.05)，因此，miR-519d可能通过负向调控STAT3来影响肿瘤的增殖及调亡。

本研究发现，在上调miR-519d的表达后，Hep-2细胞中的STAT3表达明显下降(P<0.05)，进一步证实了miR-519d对其的负性调控作用。同时，我们观察了上调miR-519d的Hep-2细胞在0～7 d的增殖情况，其增殖幅度明显低于对照组(P<0.05)，所以我们推断，miR-519d通过负性调控STAT3而影响肿瘤细胞的增殖。

此外，研究[7-8]表明，上调STAT3的表达可以促进Bcl-2的表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡；通过抑制STAT3信号通路可以诱导凋亡。我们的研究发现，通过上调miR-519d可以抑制STAT3的表达，从而使转染后24 h时的肿瘤细胞凋亡明显增加(P<0.05)，而转染后72 h时两组的细胞凋亡率差异无统计学意义，因此，抑制STAT3通路可以诱导肿瘤细胞早期凋亡的发生。

综上所述，在Hep-2细胞中，STAT3高表达，而miR-519d呈低表达，通过上调miR-519d可以抑制STAT3的表达从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。

参考文献

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[4]王俊阁,李晓明,路秀英,等. STAT3信号转导通路在喉癌中的表达及意义[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009, 16(3):115-118.

[5]钟刚,张松,孔维佳,等. STAT3蛋白在喉癌组织中的表达及意义[J]. 肿瘤防治研究，2008,35(2):104-106.

[6]张寒冰,张道宫,潘新良,等.STAT3在喉癌中的表达特征及其与Survivin表达的关系[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2008,22(2):123-126.

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通讯作者李俊，E-mail：lijun_ent@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81001201)；上海市科学技术委员会基金项目(编号：14DZ1940703)；上海市青浦区科学技术发展基金项目(编号：2011-19)