GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

黄夏冰， 康巧珍， 傅 国， 汲振余， 刘 鑫

(1.郑州大学 生命科学学院 分子免疫学实验室 河南 郑州 450000；2.河南省医药科学研究院 河南 郑州 45000)

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

黄夏冰1， 康巧珍1， 傅 国1， 汲振余2， 刘 鑫1

(1.郑州大学 生命科学学院 分子免疫学实验室 河南 郑州 450000；2.河南省医药科学研究院 河南 郑州 45000)

利用基因工程的方法，以实验室保存的pMAL-C2X-NAP质粒为模板，PCR扩增NAP基因, 构建重组质粒pGEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白，最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化，Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明，pGEX-NAP重组质粒构建正确，在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达，可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后，经Western Blot 验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.

GST-NAP； 重组质粒； 蛋白表达； GST标签

0 引言

HP-NAP是幽门螺杆菌中的一种能趋化并激活中性粒细胞的可溶性蛋白，它能促进中性粒细胞黏附胃黏膜内皮，并且能够刺激中性粒细胞产生大量的氧自由基.到目前为止，HP-NAP被证实是Dps(DNA protection during starvation)家族中唯一能够激活人类白细胞的蛋白，和HP-NAP结构相似的Flp、Dlp-1和Dlp-2都没有此功能.与其他结构相似的分子比较，HP-NAP具有独特阳离子电荷簇，这可能有利于炎症细胞的激活.已有报道，HP-NAP具有通过逆转Th1/Th2平衡，抗旋毛虫感染，抗哮喘及治疗肿瘤的潜力[1-8]，同时也被认为是极具潜力的侯选免疫调节剂[9].

HP-NAP可从幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)水抽提物中获得，然而由于H.pylori培养条件较为苛刻，无法进行H.pylori的大规模培养，且体外条件下不同菌株HP-NAP表达量差异较大，因此，大量HP-NAP的稳定获得受到较大限制[10].目前，利用基因工程的方法重组表达目的基因，能够快速简便得到大量蛋白[11].E.coli作为基因工程菌, 具有生产周期短、成本低、易线性放大等优点，且该工程菌质粒上携带有多种融合标签，有利于目标蛋白的表达纯化[12].作为E.coli原核表达系统融合标签，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)能够增加外源蛋白的可溶性[13-16].pGEX系列载体是高效表达GST的原核表达载体，其中pGEX-6P-1带有IPTG诱导启动子, 融合蛋白产物带有GST标签，因此可通过GST层析柱简便、快速地纯化，最终可以通过Prescission蛋白酶切割GST标签快速释放目的蛋白.

本研究构建了HP-NAP的原核表达质粒pGEX-NAP, 通过诱导表达、纯化得到大量的GST-NAP，经柱上切割成功去除GST标签，得到的NAP蛋白经Western Blot验证可被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.本研究为进一步研究HP-NAP的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 pMAL-C2X-NAP质粒及pGEX-6P-1质粒均为本实验室保存；E.coliDH5α、BL21(DE3)感受态购自于郑州鼎国生物有限公司.

1.1.2 试剂 Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、质粒DNA小量提取试剂盒、DNA marker购自于宝生物工程(大连)有限公司；还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽琼脂糖树脂购自于上海生工生物工程公司；低相对分子质量蛋白marker购自于北京全式金有限公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等购自于郑州鼎国生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 pGEX-NAP重组质粒的构建 首先，以本实验室构建并保存的pMAL-C2X-NAP质粒为模板扩增出HP-NAP基因，扩增HP-NAP基因的所用引物为：

F: 5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAATTTTA-3′(含有EcoRⅠ酶切位点)，

R: 5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTGCAGC-3′(含有SalⅠ酶切位点).

然后将扩增得到的HP-NAP片段和空质粒载体pGEX-6P-1用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，酶切产物胶回收后用T4 DNA连接酶于16 ℃过夜连接.最后将连接产物转化到DH5a感受态细胞中，取少量菌液涂布到含氨苄的LB固体培养基上，37 ℃培养16 h后挑取单菌落，接种于含氨苄的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，次日提取质粒.经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切电泳验证，结果正确的质粒送去测序.

1.2.2 GST-NAP融合蛋白的诱导表达 将重组质粒pGEX-NAP转化到BL21感受态细胞中，37 ℃倒置培养过夜.次日挑取单菌落，接种于5 mL LB培养基中(含Amp 100 μg/mL)，37 ℃，200 rpm活化过夜.然后按1%比例接种于500 mL LB培养基中(含Amp 100 μg/mL)，37 ℃，230 rpm扩大培养3 h.最后加入诱导剂IPTG至终浓度0.5 mmol/L，15 ℃过夜培养.取200 μL菌液，离心弃上清，SDS-PAGE电泳分析.

1.2.3 GST-NAP融合蛋白的纯化 将诱导表达后的菌液用50 mL离心管分装，4 000 rpm离心5 min，弃上清.用5 mL GST binding buffer(含有1% Triton X-100的PBS)重悬沉淀，-20 ℃冻存过夜.室温解冻后用40 mL GST binding buffer重悬，冰浴条件下使用300 W短脉冲超声处理(超声处理10 s，间隔15 s)重复20～30次至菌液透明.将超声破碎后的菌体于4 ℃、9 000 rpm离心20 min，取上清置于另一无菌的50 mL离心管中，沉淀用5 mL GST binding buffer重悬，分别对超声上清和沉淀物进行可溶性及超声破碎效果分析.取1 mL谷胱甘肽琼脂糖树脂加入到3 mL层析柱中，制备简易重力亲和层析柱.使用10 mL GST binding buffer平衡层析柱，加入菌体上清25 mL，经10 mL GST binding buffer洗涤后，使用12 mL Elution buffer(10 mmol/L还原型谷胱甘肽，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脱得到GST-NAP，并用PBS进行透析.纯化后的蛋白通过SDS-PAGE验证.

1.2.4 Prescission protease柱上切割GST-NAP融合蛋白 在1 mL层析柱中加入400 μL GST树脂，将纯化透析后的GST-NAP按照纯化步骤进行平衡、上样、洗涤.配制酶切反应体系(PP酶10 μL，10×cleavage buffer 50 μL，ddH2O 440 μL)加入到层析柱中，4 ℃反应16 h后，分多管收集流出液，并用Elution buffer洗脱蛋白.流出液及洗脱蛋白通过SDS-PAGE验证.

1.2.5 Western Blot鉴定NAP蛋白 将流出液经SDS-PAGE分离后，在110 V、65 min条件下转至硝酸纤维膜(NC)上，用1%BSA室温封闭1.5 h；使用TBST(含0.9% NaCl的10 mmol/L Tris溶液加入适量Tween-20，PH 7.4)以1∶8 000稀释的兔抗NAP抗体常温孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min；再用TBST以1∶8 000稀释的羊抗兔IgG常温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后进行增强化学发光(ECL)显色反应曝光.

2 结果

2.1 HP-NAP基因的扩增

以pMAL-C2X-NAP质粒为模板，使用带有酶切位点的引物进行PCR扩增，得到了含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的435 bp片段，与目标条带大小一致(图1).

2.2 重组质粒pGEX-NAP的酶切鉴定

利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点将HP-NAP片段克隆到pGEX-6P-1质粒中，转化到DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆菌落，摇菌提取质粒，用SalⅠ和EcoRI双酶切进行鉴定，如图2所示结果.经双酶切后得到两条条带，分别为5 000 bp(载体pGEX-6P-1)和435 bp(目的基因NAP).将重组质粒测序并在Genbank数据库中使用同源性分析软件BLAST比对测序结果，目的片段序列与数据库中的HP-NAP基因序列完全一致.

2.3 GST/NAP融合蛋白的表达、鉴定及可溶性分析

构建好的重组质粒pGEX-NAP转化BL21，挑取单菌落，扩培后提取质粒，用NAP特异性引物进行PCR鉴定.对于鉴定正确的菌株，用IPTG对菌株进行15 ℃低温诱导表达，收集菌体进行超声破碎，SDS-PAGE结果显示在43 kD处可见明显的蛋白条带，其与目标蛋白GST-NAP融合蛋白大小一致(图3).同时，菌体经超声破碎后离心，对其沉淀物和上清进行SDS-PAGE，在43 kD处均出现条带，且在同等上样条件下，上清中的目标蛋白条带更为明显.结果显示，在15 ℃诱导条件下，GST-NAP融合蛋白主要以可溶的形式存在，如图4所示.

2.4 GST-NAP融合蛋白纯化

取1 mL谷胱甘肽琼脂糖树脂加入到3 mL层析柱中，制备简易重力亲和层析柱.使用10 mL GST binding buffer平衡层析柱，加入2.3中制备的菌体上清25 mL，经10 mL GST binding buffer洗涤后，使用12 mL洗脱液洗脱.对洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，显示在43 kD处有唯一一条蛋白条带(图5).结果表明，经亲和层析得到了纯化的GST-NAP融合蛋白.

2.5 Prescission protease柱上切割GST-NAP融合蛋白

在1 mL层析柱中加入400 μL树脂，按照纯化步骤进行平衡、上样(纯化透析后的GST-NAP)、洗涤，然后加入PP酶切反应体系，4 ℃反应16 h后，分多管收集流出液，使用Elution buffer洗脱蛋白.流出液及洗脱蛋白经SDS-PAGE验证，17 kD的NAP单体存在于流出液中，洗脱蛋白为26 kD的GST标签(图6).

2.6 Western Blot 鉴定NAP蛋白

将流出液经SDS-PAGE分离后，进行转膜、封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL曝光处理得到Western Blot结果.兔抗NAP抗体与流出液中的NAP蛋白特异性结合，表明PP酶柱上切割成功获得NAP蛋白(图7).

3 讨论

由于目前大量获取HP-NAP较为困难，不利于研究应用.因而，本研究尝试用简便、高效的大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1构建重组载体pGEX-NAP，通过诱导表达、纯化得到大量的GST-NAP，经Prescission蛋白酶柱上切割GST标签后，成功得到HP-NAP.

在诱导蛋白表达过程中，当使用37 ℃诱导表达时，在0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3 mmol/L，0.4 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG浓度下， GST-NAP融合蛋白均为不可溶的包涵体蛋白.为了避免后续的变复性工作，尝试了低温诱导，当诱导温度降至15 ℃时诱导产物绝大部分为可溶的形式，并且在0.5 mmol/L IPTG条件下可溶性蛋白表达量最高.随后对纯化后的GST-NAP用Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.Prescission蛋白酶能够识别pGEX-6P-1载体表达的蛋白序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并且特异性地在Glu和Gly残基之间进行切割[17].Prescission蛋白酶在4 ℃具有最大活性，因此选择在低温下进行切割.最初尝试对结合在1 mL树脂上的GST-NAP进行直接切割，但并未成功，推断可能是由于酶切体系较小导致柱上切割不理想.随后尝试用小体积的树脂和大于树脂体积的酶切体系进行切割，最终实现GST-NAP的柱上切割.本研究提供了一种简便快速获取HP-NAP的方法，HP-NAP蛋白的表达纯化成功将为下一步研究提供重要的实验材料.

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(责任编辑：王浩毅)

Expression of Soluble GST-NAP Fusion Protein and GST-tag-cleavage on Column

HUANG Xiabing1, KANG Qiaozhen1, FU Guo1, JI Zhenyu2, LIU Xin1

(1.LaboratoryofMolecularImmunology,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.InstituteofMedcine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To obtain plenty of HP-NAP (H.pylorineutrophil-activating protein) for research, NAP gene was amplified from pMAL-C2X-NAP vector by PCR, and the recombinant plasmid pGEX-NAP was constructed. After verified by enzyme digestion and gene sequencing analysis, pGEX-NAP was transformed intoE.coliBL21(DE3)and the soluble fusion protein GST-NAP was obtained by inducing with IPTG in low temperature. Then GST-NAP was purified with Glutathione Sefinose Resin, and cleavaged GST-tag with Prescission protease on column. In conclusion, recombinant plasmid pGEX-NAP was successfully constructed and soluble GST-NAP fusion protein was efficiently expressed inE.coli. High purity HP-NAP can be obtained by Prescission protease cleavage on column. NAP protein was recognized by Rabbit anti-NAP mAb using Western Blot.

GST-NAP; recombinant plasmid; protein expression; GST-tag

2015-07-23

重大新药创制科技重大专项基金项目，编号2012ZX09103301- 022；国家自然科学基金资助项目，编号U1204817，81373119．

黄夏冰(1990—)，女，河南漯河人，硕士研究生，主要从事分子免疫研究，E-mail:huangxiabing1990@163.com；通讯作者：刘鑫(1981—)，女，甘肃白银人，讲师，博士，主要从事免疫性疾病的发病机制及治疗研究， E-mail：liux@zzu.edu.cn.

黄夏冰，康巧珍，傅国，等.GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签[J].郑州大学学报：理学版，2015，47(4)：94-98.

Q786

A

1671-6841(2015)04-0094-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.018