输合配穴针刺对LPS脑损伤幼鼠模型脑组织S100B、NSE表达的影响

胡晓丽，王雪峰，庞伟，韩洋，马贤德

实验论著

输合配穴针刺对LPS脑损伤幼鼠模型脑组织S100B、NSE表达的影响

胡晓丽，王雪峰，庞伟，韩洋，马贤德

目的 探讨输合配穴针刺干预对LPS脑损伤幼鼠模型脑组织S100B、NSE表达的影响。方法 将60只SD新生的乳鼠随机分为针刺干预组、模型组和对照组，对干预组采用输合配穴针刺21 d后，对各组大鼠脑组织中S100B、NSE含量进行检测。结果 干预组S100B、NSE的表达明显高于对照组(P<0.01)，且21 d时均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 通过对脑损伤模型脑组织S100B、NSE表达检测，明确“输合配穴”针刺法在早期干预有效性。

脑损伤； 造模； S100B; NSE; 动物，实验； 幼鼠

小儿脑损伤病因复杂，多因早产、宫内感染、新生儿缺氧缺血性脑病[1]等所导致，虽对其发病机制进行了大量研究，但迄今其病因和发病机制尚未完全明确。脑损伤引起患儿的肢体残障，给家庭和社会带来了巨大的负担，最大限度的促进残障患儿功能恢复，寻求合理、有效、副反应低的疗法仍是康复界的工作重点。王雪峰教授在多年治疗儿童瘫痪性疾病临床经验的基础上，运用输合配穴针刺疗法治疗小儿瘫痪性疾病，取得显著疗效，为进一步探讨其针刺的作用机制，本实验通过采用给予孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)的方法模拟脑损伤幼鼠动物模型[2-4]，采用“输合配穴”针刺法早期干预，为运用输合配穴针刺疗法早期干预治疗脑损伤患儿提供更有利的实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1 实验药品及制备 LPS(Lipopolysaccharides，Escherichia coli 055：B5，由Sigma公司提供)，每1 mg LPS溶于10 mL生理盐水中。

1.2 实验动物 SPF级雌性SD新生的乳鼠60只(购自辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK2010-0001)，由辽宁中医药大学动物实验中心饲养。按随机数字表法分为3组，每组20只。

1.3 方法

1.3.1 实验方法 针刺干预组：乳鼠出生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射LPS(30，30，60，60，120 μg/kg)连续注射以防止产生耐药性[1]。于生后第3天始，采用手阳明经和足阳明经的输穴和合穴，即取双侧曲池穴、三间穴、后三里穴、陷谷穴(按照实验动物学的动物穴位标准)，采用1寸毫针捻转进针，直刺穴位0.1～0.3寸，曲池穴、足三里穴采用补法针刺1～2 min，不留针；三间穴、陷谷穴采用泻法针刺1～2 min，不留针。(为避免手法差异，针刺由针灸系毕业生1人操作)，从出生后第3天开始针刺，每日1次，连续21 d；生后3 d开始，每日进行神经行为学鉴定，分别于1、7、14、21 d取乳鼠脑组织实验室检测。

模型组：乳鼠出生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射LPS(30，30，60，60，120 μg/kg)连续注射以防止产生耐药性，生后3 d开始，每日进行神经行为学鉴定，分别于1、7、14、21 d取乳鼠脑组织实验室检测。

对照组：乳鼠生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射同等剂量的生理盐水。生后3 d开始，对照组乳鼠在每日进行神经行为学鉴定，分别于1、7、14、21 d取乳鼠脑组织实验室检测。

1.3.2 神经行为学检测 平面翻正：将乳鼠翻转放置桌面上，其背部向下，记录乳鼠由仰卧位变成俯卧位时四只爪接触平台的时间。悬吊试验：使乳鼠前腿抓住一水平的玻璃棒(直径0.5 cm)，离开桌面45 cm，记录乳鼠掉下的时间，并进行评分。旷野试验：装置为36 cm×36 cm×36 cm无顶方盒，箱底用墨线分成9个等分小格，将乳鼠置于中央小方格内，观察3 min内活动情况。计分标准：乳鼠1/2以上身体从所在方格进入相邻方格记1分；乳鼠后肢站立计1分；二者相加为其总分。斜坡试验：将乳鼠头向下倒置于45°的斜坡上，记录乳鼠转为头向上>135°的时间。

1.3.3 检测方法 酶联免疫吸附法检测脑组织中的星形胶质源性蛋白(S100B)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)吸光值。

2 结果

2.1 不同时间点幼鼠神经发育测验结果 见表1。

注：与对照组比较，aP<0.05;与模型组比较，bP<0.05。

表1结果表明，干预组和模型组与对照组比较平面翻正测试比较差异有统计学意义(P<0.05)，第7天平面翻正测试，干预组与模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，第14天，干预组与模型组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表2结果表明，与对照组比较悬吊实验、斜坡实验、旷场实验比较差异有统计学意义(P<0.05)，第14天干预组与模型组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)，第21天悬吊实验、斜坡实验干预组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而旷场实验比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不同时点S100B，NSE的表达结果分析 见表3、表4。

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

表3结果表明，模型组S100B的表达明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，第1、14天模型组与干预组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，在21 d时，模型组与干预组比较有统计学意义(P<0.01)。

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表4结果表明，模型组NSE的表达明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，第1、14天模型组与干预组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，在21 d时，模型组与干预组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

脑损伤综合征是近年来在诊断高危儿患有脑性瘫痪、行为异常、运动障碍所引入过渡性诊断，多因早产、宫内感染、新生儿缺氧缺血性脑病等所导致，常用于小于6个月的婴儿，其神经系统后遗症日益受到重视。

本文依据文献的方法，建立LPS感染幼鼠模型，采用输合配穴针刺进行干预，观察其神经发育测试结果及脑组织中S100B、NSE表达，为针刺在小儿瘫痪性疾病治疗提供实验依据。传统祖国医学对“脑损伤”无专著论述，但在历代医籍中均有不少记载，多将其归属于“五迟五软”“五硬”“痿证”的范畴，中医认为因小儿脾常虚，肝常余，肢体强硬，步履不正，病机主要责之于肝强脾弱。因而在治疗上，应以柔肝健脾，抑木扶土为主。五输穴在全身腧穴中占有极其重要的位置，五输穴与五行相配伍，如阳经，合穴属土，输穴属木，并根据中医的上病下取之原理，肘膝关节以下腧穴既可治疗局部病，也可治疗远部病，从而达到和内调外，标本兼治的作用[5]。本实验提出输合配穴-抑木扶土针刺法，通过泻输补合可直接达到抑木扶土之效，即所谓“阴平阳秘，精神乃治”。

血清S100B及NSE在脑组织中具有高度特异性，对脑损伤高度敏感[5]，在血清中迅速出现，确保血清浓度和组织损伤之间有可预测的关系，是目前具有较高敏感性和特异性的最具应用前景的脑损伤标记物，对脑损伤的诊断及伤情评估具有重要的临床价值，且与神经元的损伤呈正相关，提示其可作为神经元细胞受损的早期指标之一[6]，所以本次实验选用此指标来检测所造模型鼠的脑损伤程度。

结果显示，本实验模型组的脑组织S100B、NSE含量测定与对照组相比均有显著差异，显示模型组造成新生仔鼠脑损伤，通过对各组平面翻正试验、悬吊实验，斜坡实验，旷场实验鉴定表明，使用“输合配穴”针刺法早期干预有效。今后将进一步研究脂多糖造成宫内感染模型，对其剂量及感染机制进一步研究。

[1] 肖钦志.脑性瘫痪病因学研究进展[J].南通大学学报：医学版，2013，33(3)：204-208.

[2] 李晓捷，高晶，孙忠人.宫内感染致早产鼠脑瘫动物模型制备及其鉴定的实验研究[J].中国康复医学杂志，2004，19(12)：885-889.

[3] Johnston MV, Ferriero DM, Vannucci SJ,et al. Models of cerebral palsy: which ones are best[J].J Child Neurol，2005，20(12)：984-987.

[4] Rees S, Harding R, Walker D.The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain[J].Int J Dev Neurosci，2011，29(6)：551-563.

[5] 李楠，王雪峰，张亮，等.输合配穴针刺法促进LPS早产鼠脑损伤中CNP及MBP表达的研究[J].山东医药，2012，52(36)：55-57.

[6] 尤玉慧，崔志慧，尹水贵，等.0～6个月龄脑瘫高危儿血清NSE表达特点及临床价值[J].医学研究杂志，2013，42(6)：98-101.

(本文编辑：李志文)

Effects of combined transport acupuncture on the expression of S100B, NSE and LPS of brain tissue of young rats with cerebral injury model

HUXiao-li,WANGXue-feng,PANGWei,etal.

PediatricdepartmentoftheAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，110032Shenyang，China

Objective To research the effect of acupuncture intervention on the expression of S100B、NSE of different types of brain injury model in rat brain tissue.Methods According to the model preparation method is divided into premature intervention group and non intervention group, LPS premature intervention group and non treatment group, Ischemia and hypoxia group and untreated group, LPS intervention group and the non intervention group, the normal group. The method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect S100B、NSE content in brain tissue of rats in different group.Results Rats S100B, NSE expression was closely correlated with the severity of brain injury.The expression of S100B、NSE in model group, was significantly higher than that in the blank control group (P<0.01).The results showed: the expression of S100B、NSE in brain tissue was lower than non intervention group expression in the acupuncture intervention group on twenty-first day.Conclusions The premature delivery to hypoxia and ischemia, rats, lipopolysaccharide infection detection of brain injury.S100B、NSE are not consistent in various model,maybe that related to the severity of brain injury related model.Brain tissue S100B、NSE expression was lower than non intervention group expression in the acupuncture group, which can demonstrate the use of "shu and he point" early intervention of acupuncture effectively.

brain injury； animal model； S100B； NSE； animal experiments； mice

辽宁省教育厅基金资助(L2012336) 作者单位：110032 沈阳，辽宁中医药大学附属医院儿科(胡晓丽，王雪峰)；154007 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学儿童神经康复实验室(庞伟)；110032 沈阳，辽宁中医药大学研究生学院(韩洋)；辽宁中医药大学实验中心(马贤德)

胡晓丽(1979-)，女，医学博士，主治医师。研究方向：小儿瘫痪性疾病的中医药防治。

王雪峰，110032 沈阳，辽宁中医药大学附属医院儿科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.01.008

R-33

B

1674-3865(2015)01-0020-03

2014-09-29)