不同分化阶段多能干细胞移植实验研究进展

李 君 杜 潇 周晓囡 吴嫣爽 雷 蕾

·综述·

不同分化阶段多能干细胞移植实验研究进展

李 君 杜 潇 周晓囡 吴嫣爽 雷 蕾

诱导多能干细胞是由动物体细胞重编程得到的，具有胚胎干细胞特性的全能干细胞。近年来，随着多能干细胞诱导技术的不断优化，以及体外分化技术的飞速发展，多种分化状态的多能干细胞被用于移植实验。我们结合最新研究进展，阐述各种分化阶段iPS细胞用于动物移植治疗的优缺点，以及最新移植方法所存在的问题。

诱导多能干细胞囊胚互补器官芽

胚胎干细胞是从动物早期胚胎内细胞团中分离出来的一类具有无限增殖、自我更新和多向分化特性的细胞，在细胞治疗、组织再生以及器官修复等诸多方面有着广泛的应用前景。但是，胚胎干细胞的研究与应用存在严重的伦理问题。2006年，Yamanaka等[1]通过在小鼠成纤维细胞内过表达oct4、sox2、klf4、c-myc四种转录因子，得到一种在形态功能上类似于胚胎干细胞的细胞，称为诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSC）。2007年，Thomson等[2]利用oct4、sox2、nanog、lin28四种转录因子的组合，成功获得人类iPS细胞。由于iPS细胞源于患者自身体细胞，不存在免疫排斥问题及伦理限制。随着近年来干细胞体外分化技术的成熟和发展，经过体外诱导的各种分化细胞被用于移植实验，我们以多能干细胞分化状态为线索，阐述近年来干细胞移植实验的新思路，以及最新的研究进展。

1 诱导多能干细胞移植

1.1 诱导多能干细胞动物体内移植

iPS细胞是一种多能细胞，可以分化为动物体内所有类型的细胞，理论上来说可以用于修复所有器官的损伤。2009年，Nelson等[3]利用逆转录病毒的方法导入经典四因子，将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，并移植入心肌梗死模型的免疫缺陷小鼠梗死灶内，3周左右进行B超检测，梗死部位心室壁有所增厚，但在移植部位发现了人源性肿瘤。为了避免再次出现肿瘤，实验小组将受体小鼠改为免疫功能正常的小鼠，并且降低细胞注射量，发现在心肌梗死灶内注射2×105个细胞不仅能够使细胞稳定存在8周以上，并且没有肿瘤形成。移植后的小鼠心室壁梗死部位有所增厚且射血分数增高。免疫组化显示，植入细胞表达人心肌表面标记，说明iPS细胞分化为心肌细胞，从而对损伤心脏起修复作用。有研究将猪的iPS细胞注入慢性心肌缺血、免疫功能正常的猪体内，经过3个月的体内分化，移植细胞转变为猪心肌细胞，并且有效缓解心肌缺血症状[4]。

iPS细胞用于细胞治疗，其成瘤问题不可忽视。多项研究证实，iPS细胞用于移植实验的成瘤风险高于ES细胞。由于早期iPS细胞的制备过程中采用的是逆转录病毒载体，可能引起病毒基因组与细胞基因组的整合，从而增加成瘤风险。2013年，Fink等[5]利用腺病毒载体的方法（腺病毒载体基因不整合进入细胞基因组）得到大鼠iPS细胞，并且将4×105个细胞注入大鼠纹状体内，90 d后切片观察，无肿瘤形成且所注射细胞表达成熟的神经细胞表面标记。Liu等[6]将人类多种组织来源的体细胞利用附加型载体（一种不会引起基因整合的载体）获得iPS细胞，通过尾静脉注入肝硬化模型的免疫缺陷鼠体内，移植后8周在小鼠外周血内检测到少量人白蛋白，注射细胞组相对于对照组小鼠存活率明显提高。此实验中，细胞注射量高达2×106，但在小鼠体内并未发现肿瘤。无基因重组的诱导方法大大降低了iPS细胞的成瘤风险。随着iPS诱导技术的不断发展，已经能够稳定且高效地制备出不存在基因整合的高质量iPS细胞，将此类细胞注入特定的损伤微环境内，将促进其向相应的细胞类型分化，从而修复损伤。

1.2 诱导多能干细胞囊胚内移植

近年来，干细胞疗法所面对的疾病一般都是通过细胞替代就可以治愈的疾病，比如帕金森氏病、糖尿病等，但再生医学的最终目的是通过患者自身的多能干细胞培育出正常器官，用于器官移植来代替病变器官。

Chen等[7]将野生型小鼠ES细胞植入rag2基因敲除小鼠（小鼠rag2基因缺失不能产生成熟T、B淋巴细胞）囊胚内，得到表型正常的嵌合体后代，其体内T、B淋巴细胞几乎全部来自于所注入的ES细胞。通过向发育缺陷囊胚内移植正常干细胞来修复发育障碍，以获得正常表型后代的方法称作囊胚互补。2010年，Kobayashi等[8]将小鼠成纤维细胞来源的iPS细胞植入PDX1-/-（PDX1基因缺失动物胰腺发育不全）大鼠囊胚内，出生的后代表型正常，但胰腺几乎全部由小鼠细胞发育而来，借此完成首例异种间囊胚互补实验。此实验进一步证明，存在发育缺陷的囊胚微环境会刺激外源性正常干细胞向该囊胚内急需的细胞类型分化，以产生正常表型的嵌合体后代。这种异种间嵌合体的出现，使囊胚互补技术应用于临床成为了可能。

2013年，Matsunari等[9]利用PDX1基因敲除的成纤维细胞核作为供体，通过二次核移植，得到PDX1-/-胚胎，并在体外培养到桑葚胚阶段，向此胰腺发育不全的桑葚胚内注射带有荧光标记的正常猪胚胎干细胞，然后将嵌合体胚胎植入代孕母猪体内，出生的小猪表型正常，胰腺细胞几乎全部带有荧光标记，首次在大动物身上成功完成了囊胚互补实验。

实验过程中构建了一个发育缺陷的猪囊胚，若将注入的细胞改为人类的iPS细胞，能否像大小鼠间产生胰腺一样跨越种间屏障而得到人类嵌合体器官呢？如果通过囊胚互补技术得到了人类器官，虽然器官内会有少量猪细胞嵌合，但由于所得器官绝大部分由患者iPS细胞发育而来，将不会引起过于强烈的排斥反应。α1，3-半乳糖苷酶基因敲除猪[10]（α1，3-半乳糖苷酶是引起异种间器官移植超急性免疫排斥反应的主要抗原）的出现，使目的器官内少量猪细胞引起的轻微免疫排斥反应更加微不足道。

利用囊胚互补原理，将iPS细胞向胚胎内移植是近年来才出现的方法，由于细胞移植发生在动物建立免疫耐受的胚胎阶段，该方法巧妙地避开了免疫排斥反应，但还需要进一步的研究和完善。

2 诱导多能干细胞体外分化后移植

2.1 多能干细胞诱导分化为功能细胞进行移植

随着对胚胎发育分子机制了解的深入，已经能够通过各种小分子模拟胚胎干细胞在体内的分化过程，将多能干细胞在体外诱导为有功能的分化细胞，再植入动物体内进行研究。

Ⅰ型糖尿病是由于自身免疫系统攻击胰岛B细胞而导致的胰岛素分泌障碍，患者必须每天注射胰岛素，否则将危及生命。2012年，Bellin等[11]将人类异体胰岛移植入Ⅰ型糖尿病患者体内，患者5年内不需要注射胰岛素。由于植入的是异体胰岛，所以需要同时服用免疫抑制剂以降低免疫排斥反应。2014年，Hrvatin等[12]在体外模拟胰岛细胞的分化过程，将人iPS细胞诱导为定型内胚层细胞，再诱导为胰岛前体细胞，最后通过小分子的刺激，得到表达胰岛B细胞表面标记（INS+）的细胞。这种细胞在体内外均可分泌少量胰岛素，但不会因为外周葡萄糖浓度的改变而改变胰岛素的分泌量，并不具备血糖敏感性，因此不能用于细胞治疗。全基因表达谱分析，这种细胞与人类胎儿胰岛B细胞更相近，并不是具有血糖调节功能的成年胰岛细胞。同年，Pagliuca等[13]优化胰岛前体细胞成熟步骤，从70多种小分子化合物，150多种组合中挑选出一组能够高效诱导胰岛前体细胞成熟的分子组合。所得到的细胞命名为SC-b细胞（stem-cell-derived b cells）。将SC-b细胞移植入免疫缺陷鼠肾被膜下，2周后可在外周血内检测到人胰岛素分泌，给予小鼠不同浓度的葡萄糖刺激，小鼠外周血内人类胰岛素分泌量与其血糖浓度呈正相关。患者自身体细胞来源的SC-b细胞理论上来说是一类不存在免疫排斥反应，且具有血糖敏感性的胰岛素分泌细胞，完全可以替代自身受损的胰岛B细胞完成胰岛素分泌功能。通过体外诱导得到的SC-b细胞虽然与正常胰岛B细胞存在一些基因表达以及表观修饰上的差异，但也属于一种自身胰岛B细胞，移植入患者体内可能会遭到自身免疫系统的攻击而导致功能丧失。因此，SC-b细胞目前还不能应用于临床治疗。

终末期肝脏疾病的患者可以通过移植大量正常肝细胞来进行治疗，但是由于可供移植的肝脏细胞来源有限且很难在体外进行扩增培养，所以寻找合适的肝细胞源成为肝细胞移植的首要问题。2010年，Si-Tayeb等[14]将人iPS细胞诱导为定型内胚层细胞，再诱导为肝脏祖细胞，最后通过几种小分子促进肝脏祖细胞转变为成熟肝细胞。Liu等[6]将这种方法得到的人类肝脏细胞，通过尾静脉注入肝硬化模型的免疫缺陷鼠体内（2×106个/只），明显提高了模型小鼠的存活率（注射细胞组8周存活率85%左右；对照组8周存活率40%左右）。细胞注射8周后处死，在小鼠肝脏内检测到12%左右的人类成熟肝脏细胞嵌合。说明所注入的人类诱导肝细胞不仅能够正常分泌人白蛋白（ALB），还可嵌合在受体肝实质内稳定存在。

随着干细胞分化技术的成熟，类似的实验不胜枚举。比如将人iPS细胞在体外诱导为多巴胺能神经细胞，注入大鼠脑内治疗帕金森氏病[15]；把人iPS细胞诱导为造血干细胞治疗小鼠镰刀状细胞贫血症[16]等。

2.2 诱导多能干细胞为微器官进行移植

上述的细胞移植实验，一类是静脉注射细胞悬液，利用细胞趋向性定植在目的位点；一类是原位移植细胞团块。前者会使移植细胞随血流在体内散状分布，引发不可控的后果。后者移植的细胞团块可由于黏附不牢而脱落，亦或随着细胞增殖，团块内部营养不良导致坏死而引起一系列的不良反应。

正常肝脏在发生过程中形成“肝膨大”，与此同时，间质细胞与血管内皮祖细胞立即在“肝膨大”内形成网状分布的血管。Takebe等[17]为了模拟这一过程，将人iPS分化来的肝祖细胞、人脐静脉内皮细胞、人类间充质干细胞共培养于一个培养皿内，48 h后，培养皿内混合细胞自发组装成一个含有血管的三维团块——“肝芽”。全基因表达谱分析，此“肝芽”类似于人类3~4周的胎肝，并不具备成熟肝脏的功能。由于血流动力学的刺激有利于肝脏的成熟，实验组又将“肝芽”移植入免疫缺陷鼠颅腔内，48 h左右宿主血管开始与“肝芽”内血管相融合，进行营养供应，并在第6天左右开始分泌人血清白蛋白，行使成熟肝脏功能。移植“肝芽”虽然不能像移植成熟肝脏细胞一样迅速发挥功能，但其成熟后所分泌人ALB的量和持续时间，是远远超过直接移植成熟肝脏细胞的。这种源于患者自身体细胞的“器官芽”不仅不存在免疫排斥反应，而且还具有“扎根”和“成长”的能力，用于移植治疗的效果必然远优于单纯的功能细胞移植。

随着体外“肝芽”组织的诱导成功，人们开始尝试在体外诱导其他器官。2013年，Huang等[18]将人类ES/iPS细胞在体外诱导为肺祖细胞，将未经纯化的NKX2.1+FOXA2+细胞植入小鼠肾被膜下，6个月后切片观察，移入的细胞自发分化为含有肺泡、支气管、平滑肌、软骨等所有结构的微型肺脏。同年，Takasato等[19]将体外诱导来的人肾祖细胞与12.5~13.5 d的胎鼠肾脏细胞悬液共培养4 d，得到人类细胞组装在肾小球部位的嵌合体肾单位。McCracken等[20]利用人类干细胞在体外培养出具有腺体结构且能够容纳肠道细菌的“微型胃”。这些结果说明，在特定条件下将早期支持细胞与功能性祖细胞共培养，会趋向于形成正常结构的“器官芽”，可直接用于移植治疗或植入受体促其成熟后再用于移植。

3 展望

iPSC的出现，可以得到具有多向分化能力的全能细胞，避免了免疫排斥和伦理问题。随着干细胞体外诱导技术的飞速发展，人们已经可以将干细胞诱导为人体大部分类型的细胞。2014年9月，成功地将老年性黄斑变性患者皮肤来源的iPS细胞诱导为视网膜色素上皮细胞薄层，替换其受损视网膜，完成了世界上首例iPS细胞治疗，并获得满意疗效。

但相关技术中存在的问题是不可忽视的，比如“囊胚互补”所得器官内的异种细胞嵌合如何解决？结构不规则的“器官芽”怎样与患者组织相吻合？芽体成熟后能否感知患者体内信号变化，并发挥相关功能等问题，还需进一步探索解决。

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[2]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J]. Cell,2007,131(5):861-872.

[3]Nelson TJ,Martinez-Fernandez A,Yamada S,et al.Repair of acute myocardialinfarctionbyhumanstemnessfactorsinduced pluripotent stem cells[J].Circulation,2009,120(5):408-416.

[4]Zhou Y,Wang S,Yu Z,et al.Induced pluripotent stem cell transplantation in the treatment of porcine chronic myocardial ischemia[J].Ann Thorac Surg,2014,98(6):2130-2137.

[5]Fink KD,Rossignol J,Lu M,et al.Survival and differentiation of adenovirus-generated induced pluripotent stem cells transplanted into the rat striatum[J].Cell Transplant,2014,23(11):1407-1423.

[6]Liu H,Kim Y,Sharkis S,et al.In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins[J]. Sci Transl Med,2011,3(82):82ra39.

[7]Chen J,Lansford R,Stewart V,et al.RAG-2-deficient blastocyst complementation:an assay of gene function in lymphocyte development[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1993,90(10):4528-4532. [8]Kobayashi T,Yamaguchi T,Hamanaka S,et al.Generation of rat pancreasinmousebyinterspecificblastocystinjectionof pluripotent stem cells[J].Cell,2010,142(5):787-799.

[9]Matsunari H,Nagashima H,Watanabe M,et al.Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(12):4557-4562.

[10]Lutz AJ,Li P,Estrada JL,et al.Double knockout pigs deficient in N-glycolylneuraminic acid and Galactose α-1,3-Galactose reduce the humoral barrier to xenotransplantation[J].Xenotransplantation,2013,20(1):27-35.

[11]Bellin MD,Barton FB,Heitman A,et al.Potent induction immunotherapy promotes long-term insulin independence after islet transplantation in type 1 diabetes[J].Am J Transplant, 2012,12(6):1576-1583.

[12]Hrvatin S,O'Donnell CW,Deng F,et al.Differentiated human stem cells resemble fetal,not adult,beta cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(8):3038-3043.

[13]Pagliuca FW,Millman JR,Gürtler M,et al.Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro[J].Cell,2014,159 (2):428-439.

[14]Si-Tayeb K,Noto FK,Nagaoka M,et al.Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells[J].Hepatology,2010,51(1):297-305.

[15]Wernig M,Zhao JP,Pruszak J,et al.Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(15):5856-5861.

[16]Hanna J,Wernig M,Markoulaki S,et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin[J].Science,2007,318(5858):1920-1923.

[17]Takebe T,Sekine K,Enomura M,et al.Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant[J]. Nature,2013,499(7459):481-484.

[18]Huang SX，Mn I，O'Neill J,et al.Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells[J]. Nat Biotechnol,2014,32(1):84-91.

[19]Takasato M,Er PX,Becroft M,et al.Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a selforganizing kidney[J].Nat Cell Biol,2014,16(1):118-126.

[20]McCracken KW,Catá EM,Crawford CM,et al.Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids[J].Nature,2014,516(7531):400-404.

Transplantation Studies of Pluripotent Stem Cells at Different Differentiated Stages

LI Jun,DU Xiao,ZHOUXiaonan,WU Yanshuang,LEI Lei.
Department of Histology and Embryology,Harbin Medical University,Harbin 150081, China.Corresponding author:LEI Lei(E-mail:leiys2002@yahoo.com).

【Summary】Induced pluripotent stem cells(iPSCs)derived from reprogrammed somatic cells,are totipotential cells similar to embryonic stem cells.Recently,iPSCs inducing technology has been promptly improved in methods of induction and differentiation in vitro.Consequently,iPSCs at different differentiated stages have been widely used in cell transplantation experiments.Here,the current researches of iPSCs transplantation were summarized,some novel methods comparing with the older one and some problems need to be resolved before iPSCs could be applied in clinic therapy were all reviewed.

Induced pluripotent stem cells;Blastocyst complementation;Organ bud

Q813.1

B

1673－0364（2015）04－0266－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.013

2015年5月19日；

2015年7月8日）

国家973项目（2012CBA01303）。

150081黑龙江省哈尔滨市哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室。

雷蕾（E-mail：leiys2002@yahoo.com）。