白首乌C21甾苷对慢性心力衰竭大鼠新生血管形成及胰岛素样生长因子-1表达的影响

惠 勇

黑龙江省牡丹江市第二人民医院老年病科，黑龙江牡丹江 157011

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是常见的心血管疾病， 常伴有心血管系统血流动力学障碍及神经内分泌代谢功能紊乱[1-2]。 世界范围内大约有15 亿例CHF 患者，每年新增病例400 万例[3]。现阶段，CHF 是65 岁老人住院的主要原因[4]。 因此，寻找CHF安全有效的治疗方法或治疗药物显得尤为重要。白首乌C21甾苷能够清除超氧阴离子自由基和羟自由基，是白首乌中的主要活性成分[5]，但是，其对CHF 的影响鲜见报道。 本研究旨在观察白首乌C21甾苷对CHF大鼠左心室顺应性、微血管密度（MVD）、CD34+细胞动员及胰岛素样生长因子-1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1）表达的影响，为明确白首乌C21甾苷防治CHF 提供实验依据，探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级Wistar 系大鼠40 只，体重200～250 g，购于哈尔滨医科大学动物实验中心，实验动物合格证号：P00102012， 实验动物使用许可证号：SYXK （黑）2012-033。 饲养于标准环境， 自由饮食，12 h 光照周期。 所有实验操作均遵守《中国动物实用指南》。

1.2 白首乌C21 甾苷的提取

白首乌C21甾苷由牡丹江市第二人民医院炮制室制备。经紫外分光光度法分析，C21甾苷含量达65%左右（按孕甾烯醇酮计）。

1.3 方法

1.3.1 心肌梗死后CHF 模型的建立及实验分组 参照文献[6-8] 方法实施左冠状动脉前降支结扎术建立CHF 模型。共成功建立CHF 模型17 只，成功率为56.7%。随机分为两组：模型组8 只，给予等体积生理盐水；白首乌C21甾苷组9 只，参照文献[9]并结合预实验结果，给予白首乌C21甾苷1.0 g/kg。另设假手术组10只，开胸后在左冠状动脉前降支下方只穿线不结扎，等体积生理盐水灌胃。 各组均为1 次/d 灌胃，共3 周。

1.3.2 流式细胞术 大鼠尾静脉采血0.5 mL、枸橼酸钠抗凝、Pharmingen 染色缓冲液稀释。取2 根试管，各加入100 μL 全血， 然后1 管加入20 μL PE/cy5 antimouse CD34， 另1 管加入20 μL anti-CD34-FITC 暗处孵育25 min 后，加入2 mL 红细胞裂解液，混匀，上机分析，计数10 000 个细胞。Cell Quest Pro 软件进行分析CD34+细胞阳性率。

1.3.3 左心室舒张期压力-容积曲线 大鼠断颈处死、心包膜剪开、肺动脉切断、主动脉插管、制备Langendorff 心脏。 通过贝朗Infusomat P 型容积输液泵灌流改良KH（Krebs-Henseleit）灌流液。 由心尖部将双腔心导管引入左心室，另一端连接HM10 高精度压力传感器。 把心脏放入37℃保温槽，逆灌10 min，改为顺灌10 min，稳定10 min。 剪开左心耳，经左心房将自制顶端有乳胶球囊的聚乙烯导管插入左心室，乳胶球囊注入37℃KH 液。 最初量为0.1 mL， 并以此量递增，共7 次，终容积为0.7 mL，4 s/次。 SLY-B 四道生理记录仪同步记录不同球囊容积时左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张期末压（LVEDP）、平均左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。 以LVEDP 为纵坐标，左心室球囊容积为横坐标，绘制左心室压力-容积曲线，以此反映心肌舒张期顺应性[10-12]。 测定完成后，取心脏，剪去心房和血管组织，从心室处沿室间隔剪开，用于后续实验。

1.3.4 MVD 测量 心肌组织标本4.0%多聚甲醛固定、石蜡包埋、苏木精-伊红（HE）染色，显微镜观察。随机选择3 个高倍视野进行拍照。Image-pro Plus 6.0 软件系统进行微血管计数，取其平均值。

1.3.5 Western blot 分析 心肌组织标本在蛋白酶抑制剂存在下匀浆，以获得蛋白提取物。 Bradford 法测定蛋白质含量。 95℃变性5 min，随后进行电泳。 电泳后，电转至0.45 μm 硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉PBST 封闭1 h，分别加入抗IGF-1 抗体（1∶2000 稀释）4℃孵育过夜。 加入HRP 标记的二抗（1∶2000 稀释）室温孵育2 h。 按同样的方法与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体孵育。 ECL 化学发光试剂显色，通过Bio-Rad 凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。蛋白的相对表达强度=目标蛋白表达强度/GAPDH 蛋白表达强度。

1.3.6 Real-Time PCR 分析 按照Trizol 试剂盒说明书抽提总RNA。 Nanodrop 2000 检测RNA 纯度。 使用M-MLV 逆转录试剂盒（reverse transcriptase kit promega，Japan）进行逆转录反应成单链的cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。 利用PubMed 查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0 设计引物，引物序列见表1。 使用Quant SYBR Green PCR kit 按照PCR 引物进行扩增，用Applied Biosystems 7500 型定量PCR 仪测出ΔC 值及熔解曲线，计算出相对基因表达量。 每份样品检测3 次。

表1 Real-Time PCR 序列

1.4 统计学方法

采用Graphpad 5.0 软件进行描述性统计，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t 检验，多样本均数采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左心室舒张期压力-容积曲线

随着左心室球囊容积的逐渐递增，与假手术组比较，模型组左心室顺应性下降（P ＜0.05）。 白首乌C21甾苷组可见曲线较模型组向左上移位 （P ＜0.05），说明白首乌C21甾苷可改善CHF 大鼠左心室心肌顺应性。 见图1。

图1 各组大鼠左心室舒张期压力-容积曲线

2.2 各组大鼠心肌组织MVD 比较

与假手术组比较，模型组MVD 明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，白首乌C21甾苷组MVD 明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05），说明白首乌C21甾苷促进CHF 大鼠新生血管的形成。 见表2。

表2 各组大鼠心肌组织MVD 比较（血管数/mm2，±s）

表2 各组大鼠心肌组织MVD 比较（血管数/mm2，±s）

注：与假手术组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，＃P ＜0.05；MVD：微血管密度

组别 只数 MVD假手术组模型组白首乌C21 甾苷组10 89 0.173±0.042 0.018±0.005*0.146±0.037＃

2.3 各组大鼠CD34+细胞阳性率比较

与假手术组比较，模型组的CD34+细胞阳性率升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，白首乌C21甾苷组的CD34+细胞阳性率升高， 差异有统计学意义 （P ＜0.05）， 说明白首乌C21甾苷可增强CD34+细胞动员到外周血。 见表3。

表3 各组大鼠CD34+细胞阳性率比较（%，±s）

表3 各组大鼠CD34+细胞阳性率比较（%，±s）

注：与假手术组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，＃P ＜0.05

组别 只数 CD34+细胞阳性率假手术组模型组白首乌C21 甾苷组10 89 43.71±11.26 52.87±13.28*68.21±17.11＃

2.4 各组大鼠IGF-1 Western blot 分析结果

与模型组比较，白首乌C21甾苷组IGF-1 表达水平显著增强，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 见图2。

图2 各组大鼠IGF-1 Western blot 分析结果

2.5 各组大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR 分析结果

与模型组比较，白首乌C21甾苷组的IGF-1 mRNA表达水平显著增强，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR 分析结果

3 讨论

CHF 是各种心脏疾病的终末阶段，是各种心脏病变引起心脏功能和结构的变化，最后导致心室泵血功能低下的临床综合征[13-16]。 本研究结果表明，白首乌C21甾苷可有效改善CHF 大鼠左心室顺应性，说明其对衰竭心肌有明显的保护作用。

CD34+细胞是血管内皮祖细胞和造血干细胞的共同标志物，而且是目前公认的外周血骨髓干细胞的标志物[17]。 CD34+细胞能分化为内皮细胞，定向迁移到缺血或损伤部位并参与局部的血管新生[18]。 另有研究表明，IGF-1 在CD34+细胞向内皮细胞诱导分化中也起着十分重要的作用[19]。IGF-1 是重要的心源性激素，发挥类似胰岛素的作用， 在新生血管的形成过程中，起决定性的作用，表现为表达增强[20]。 本研究结果发现，白首乌C21甾苷可使CHF 大鼠MVD 显著增高， 说明其可促进新生血管的形成。 为确定其可能机制，本研究采用流式细胞术测定了外周血CD34+细胞的阳性细胞百分率。 结果发现，白首乌C21甾苷可使CD34+细胞动员至外周血增加，提示其促新生血管形成的作用可能与动员CD34+细胞至外周血有关。 进一步采用Western blot 和Real-Time PCR 分析检测了IGF-1 蛋白和IGF-1 mRNA 的表达， 发现白首乌C21甾苷可使IGF-1 蛋白和IGF-1 mRNA 呈高表达。 因此，认为白首乌C21甾苷促进新生血管的形成机制可能是其使IGF-1 诱导CD34+细胞动员至外周血， 从而促进新生血管的形成。

综上所述，白首乌C21甾苷可有效改善CHF 大鼠左心室顺应性，对衰竭心肌有明显的保护作用。 同时白首乌C21甾苷促进新生血管的形成， 其机制可能与IGF-1 诱导CD34+细胞动员至外周血有关。

[1] 占宏静，邝山，陈秋霞，等.左甲状腺素钠治疗慢性心力衰竭的效果及对血清细胞因子的影响[J].中国医药导报，2015，12（7）：102-105.

[2] 赵嘉晶，曹飞，岳瑶函，等.慢性心力衰竭患者LDH 与血浆BNP 及中医证型相关性研究[J].西部中医药，2014，27（9）：78-80.

[3] Fukuda T，Matsumoto A，Kurano M，et al. Cardiac output response to exercise in chronic cardiac failure patients [J].Int Heart J，2012，53（5）：293-298.

[4] Bos-Touwen I，Schuurmans M，Monninkhof EM，et al. Patient and disease characteristics associated with activation for self-management in patients with diabetes，chronic obstructive pulmonary disease，chronic heart failure and chronic renal disease：a cross-sectional survey study [J].PLoS One，2015，10（5）：0126400.

[5] 陈美华，吴娟娟，朱玉云，等.白首乌对实验性小鼠抗氧化及耐缺氧作用的研究[J].中国食物与营养，2010，16（1）：71-73.

[6] 王加佳，夏中元，赵博，等.DJ-1/PTEN 通路在糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注期间对心肌损伤的影响[J].中国现代医学杂志，2013，23（23）：37-40.

[7] 邹吉丽，尹照萍，张利群，等.大鼠心肌缺血再灌注早期心肌及血清中IL-6、TNF-α 的表达[J].中国医科大学学报，2013，42（9）：830-833.

[8] 陈萌萌，李艳芳，彭余波.长效硝酸酯对心力衰竭大鼠心脏血管紧张素Ⅱ受体表达水平的影响[J].心肺血管病杂志，2015，34（1）：57-61.

[9] 陆佳静，王晓岚，姚文杰，等.白首乌C21甾苷对小鼠脑缺血再灌注致学习记忆损伤的保护作用[J].中成药，2009，31（3）：463-465.

[10] 饶曼人，孙兰，张晓文.前胡香豆素组分对心脏肥厚大鼠心脏血流动力学、心肌顺应性及胶原含量的影响[J].中国药理学与毒理学杂志，2002，16（4）：265-269.

[11] 徐毅，饶曼人.粉防己碱对DOCA 盐性高血压心肌肥厚大鼠心脏血流动力学的影响[J].药学学报，1995，30（2）：86-92.

[12] 张改改，滕旭，刘越，等.离体大鼠心肌内质网应激模型构建条件的优化[J].中国实验动物学报，2013，21（6）：1-7.

[13] 梁丽萍，潘勇翔，陈虹，等.曲美他嗪对慢性心力衰竭患者心功能及血清基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶抑制剂-1 的影响[J].中国医药导报，2014，11（18）：86-88.

[14] 李心畅，赵欣.辛伐他汀对慢性心力衰竭患者脑钠肽及肿瘤坏死因子-α 的影响[J].中国现代医生，2013，51（29）：61-62，65.

[15] 刘佳.左卡尼汀治疗老年慢性心力衰竭患者的疗效观察[J].中国现代医生，2013，51（19）：58-59.

[16] 陈润龙，陈进.奥美沙坦对慢性心力衰竭患者血浆脑钠肽、IL-23 及左室舒张功能的影响[J].中国现代医生，2014，52（13）：59-61，64.

[17] 詹文捷，唐由之，江伟，等.明睛颗粒对激光诱发脉络膜新生血管后骨髓细胞动员的影响[J].中药新药与临床药理，2012，23（5）：526-530.

[18] 穆桂萍，曾瑶池，陈鹏典，等.针刺任督脉对脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子和CD34 表达的影响[J].中国医药导报，2013，10（25）：18-22.

[19] 韩丽华，王振涛，索红亮，等.益气活血方对大鼠缺血心肌血管新生及缺血心肌局部胰岛素样生长因子-1 表达的影响[J].中医杂志，2007，48（3）：262-264.

[20] 赵雅彬，高洁，王宝玉，等.儿茶素治疗老年慢性心衰患者的临床疗效及其对脂联素、胰岛素样生长因子-1 的影响研究[J].中国生化药物杂志，2015，35（4）：126-128.