高效液相色谱法测定清肝利胆排石丸中虎杖苷含量

陈 刚

(湖南省张家界市食品药品检验所，湖南 张家界 427000)

清肝利胆排石丸系张家界市中医院制剂注册品种，协定处方由酸泡根、茵陈、虎杖、金钱草等12 味药物组方，具有清肝利胆、排石止痛等功效，方中虎杖所含虎杖苷(又名白黎芦醇苷)具有保肝、利胆和抗菌作用，主要用于治疗胆石症、胆囊炎、急慢性肝炎等病症。该品种原质量标准比较简单，仅规定了性状、薄层色谱鉴别等检验项目，未制订含量测定检测指标。为较好地控制制剂内在质量，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法对清肝利胆排石丸中虎杖之虎杖苷进行含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

美国Waters E2695 型高效液相色谱仪，Waters2489 型UV 检测器，Empower2 色谱工作站;AUW220D 型电子分析天平(日本岛津);1020a 超纯水机(重庆摩尔);KQ2200DB 型数控超声波清洗器(昆山超声仪器公司)。虎杖苷对照品(批号为111575-200502，供含量测定用，中国药品生物制品检定所);清肝利胆排石丸(张家界市中医院制剂室，批号为130120，130502，131202);乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(20 ∶80);检测波长:306 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μL。理论板数按虎杖苷峰计应不低于3 000。

2.2 溶液制备

取本品适量，研细，取约2.5 g，精密称定，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。五氧化二磷干燥器中减压干燥24 h，精密称取虎杖苷对照品11.26 mg，置100 mL 容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含0.112 6 mg 的溶液，作为对照品溶液。另按处方组成[2]，制成缺虎杖的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验:精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照品溶液色谱图中，在虎杖苷峰相应的保留时间附近无干扰峰，阴性无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取虎杖苷对照品溶液(0.112 6 mg/mL)1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，以0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，按上述色谱条件测定。以虎杖苷进样量(μg)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程Y=4 251 854.351 7 X - 850.400 0，r=0.999 9(n=6)。结果表明，虎杖苷进样量在0.112 6 ～0.788 2 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，重复进样6 次，测定峰面积。结果的RSD 为0.71%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24 h 时进样，测定虎杖苷的峰面积。结果的RSD 为1.05%(n=6)，表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。

重复性试验:取同一批(批号为130120)样品6 份，每份约2.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果平均含量为1.52 mg/g，RSD 为0.73%(n=6)，表明方法重复性较好。

加样回收试验:取已知含量(1.52 mg/g)样品6 份，分别精密加入虎杖苷对照品溶液(0.112 6 g/L)5.0，10.0，15.0 mL，照供试品制备方法制成供试液，依法(进样10 μL)测定虎杖苷的含量，计算回收率。结果见表1。

表1 虎杖苷加样回收试验结果( n=6)

2.4 样品含量测定

取3 个不同批号(130120，130502，131202)的样品，依法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定虎杖苷的峰面积，以标准曲线计算含量。结果3 批次样品中虎杖苷的含量分别为1.52，0.83，0.62 mg/g。

3 讨论

以HPLC 法测定虎杖苷的含量，采用乙腈-水进行梯度洗脱者较多，为使操作简化又不影响分析效果，选用乙腈-水等度系统作为流动相。经多次试验发现，乙腈-水(20 ∶80)为流动相配比时，峰形较好，保留时间适中，能使本样品中虎杖苷峰与相邻色谱峰达到基线分离，且阴性对照无干扰。

供试品溶液提取溶剂的选择参照2010 年版《中国药典(一部)》和文献[3]进行筛选，曾用不同浓度甲醇、乙醇分别进行超声、加热回流提取。试验结果表明，以50%乙醇(稀乙醇)回流提取30 min，虎杖苷含量较高，重复性、稳定性较好。

样品含量在0.62 ～1.52 mg/g 之间，批次间差异悬殊，且近期产品含量较低。经查，主要是生产过程中温度控制不严所致。生产时应严格按工艺流程控制温度，并不得随意延长干燥、烘烤时间，以确保质量可靠、安全有效。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部) [M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：194.

[2] 湘药制字Z20080881，医院制剂注册审批确认标准[S].

[3] 柯长青，蒋永海. 高效液相色谱法测定金胆片中虎杖苷含量[J]. 中国药业，2006，15(13)：33.