免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱法检测中药材中赭曲霉毒素A

李 浩

(广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021)

赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素中最主要的一种，在紫外光下显绿色荧光，属于稳定的无色结晶化合物，呈弱酸性，溶于极性溶剂和碳酸氢钠溶液，微溶于水，溶点为165 ℃[1-2]。目前，已知赭曲霉毒素A 能致癌、致畸、破坏免疫系统，对肾脏造成损害，还可导致神经中毒[3]。世界上许多国家和涉及安全卫生的国际组织已制订了对赭曲霉毒素A 的限制性法律法规或限量标准[4-6]。中药材在生长、收获、运输、贮藏、加工等过程中均有被霉菌污染的可能性，我国现行国家标准中赭曲霉毒素A 的检测方法为薄层色谱(TLC)法和酶联免疫吸附(ELISA)法。免疫亲和柱是20 世纪90 年代在分析领域得到应用的新技术，溶液样品的大分子通过与亲和柱体内的特异蛋白结合，得到纯度较高的特异性结合蛋白，再用合适的洗脱液将特异性结合蛋白洗脱出来，从而达到分离、纯化的目的，由于该过程去掉了绝大部分干扰物，故大大提高了信噪比和方法的检出限。对于含有多种干扰物质的中药材，如何减少干扰是准确测定赭曲霉毒素A 最重要的前提，为此，笔者进行了试验，现报道如下。

1 仪器与试药

Ochra TestTM免疫亲和柱(美国维康、德国拜发公司);Waters2695型液相色谱仪、Waters 2475 型荧光检测器;KQ-100DB 型数控超声波清洗器超声机(昆山市超声仪器有限公司);电子天平(Electronic Scale);pH 计(Mettler Toledo);高质量空气泵(Hailea Aco-5502)。赭曲霉毒素A 标准品(Alexis 公司);乙腈、甲醇均为Fisher Scientific 色谱纯;试验用水均为超纯水(Milli-Q Academic 0.22 μm 超纯水机);磷酸盐缓冲液(PBS，16 g 氯化钠+2.4 g 磷酸氢二钠+0.4 g 磷酸二氢钾+0.4 g 氯化钾，用990 mL 水溶解，再用浓HCL 调pH 至6.8，水稀释至1 000 mL);洗脱液为5%吐温(吐温∶水=5 ∶95);提取液为80%甲醇;稀释液为吐温20 ∶PBS(5 ∶95)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm);柱温:35 ℃;样品温度:10 ℃;流动相:乙腈-水-乙酸(49.5 ∶49.5 ∶1.0);流速:1 mL/min;检测器:荧光检测器;检测波长:激发波长333 nm，发射波长460 nm。在此色谱条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取赭曲霉毒素A 标准品(标示装量为1.0 mg)，精密称定0.99 mg，分次用乙腈溶解并转移至10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为贮备液(约100 μg /mL)。精密量取贮备液1 mL，用乙腈稀释至含赭曲霉毒素A 约为1 000，10，2 ng/mL 的对照品溶液。取供试品粉末约5 g，精密称定，加入2 ～3 g 氯化钠，精密加入80%甲醇溶液50 mL，超声10 min，玻璃滤纸滤过，精密量取滤液10 mL，置25 mL 容量瓶中，加含5%吐温20 的pH=6.8 PBS 稀释至刻度，摇匀，玻璃滤纸滤过，精密量取续滤液10 mL，过赭曲霉免疫亲合柱，流速为1 mL/min，用水20 mL 分2 次洗柱，洗液弃去，使空气进入柱子，精密量取甲醇1.0 mL 分2 次洗脱，洗脱速度为0.5 mL/min，收集洗脱液，用甲醇定容至1 mL，即得供试品溶液。

2.3 测定方法

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，用外标法计算供试品中赭曲霉毒素A的含量。以外标法定量、保留时间定性、峰面积定量，样品中赭曲霉毒素A 含量按以下公式计算，X(ng/g)=(Ai× Cs× V)/(As×m)。式中，X 为样品中含量(ng/g)，Ai为样品溶液赭曲霉毒素A的峰面积，As为对照品溶液赭曲霉毒素A 的峰面积，Cs为对照品溶液质量浓度(ng/mL)，V 为稀释体积，m 为样品质量(g)。

2.4 方法学考察

最低检出限测定:取赭曲霉毒素A 对照品溶液(质量浓度为1.98 ng/mL)进样，根据信噪比S/ N=3 为检出限，S/ N=10 为定量限，以赭曲霉毒素A 计，测定结果见表1。

线性关系考察:取对照品溶液(10 ng/mL)分别进样5，10，20 μL，赭曲霉毒素A 对照品溶液(40 ng/mL)分别进样5，10，20μL，以峰面积(Y)为纵坐标、赭曲霉素A 的绝对量(X，ng)为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=3051457X-87602，r=0.9996(n=3)。结果表明，进样量在50 ～800pg 范围内与峰面积线性关系良好。

表1 最低检出限测定结果

精密度试验:将1.98 ng/mL 的对照品溶液连续进样5 次，每次20 μL，以赭曲霉毒素A 峰的峰面积值计算。结果的RSD 为0.7%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取样品5 份，按拟订方法制备供试品溶液，依法进样测定。结果的RSD 为3.7%(n=5)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:选择易染赭曲霉毒素同时代表不同类型的中药材，测定样品的赭曲霉残留量。取白术样品进行加样回收试验，添加以赭曲霉毒素A 计分别为高(40.0 ng/g)、中(25.0 ng/g)、低(2.5 ng/g)3 个质量浓度。分别取样品5 g，各加入对照品溶液(赭曲霉毒素A 含量为1 000 ng/mL)200，125，12.5 μL，分别加80%甲醇溶液至50 mL，按拟订方法制备供试品溶液，依法进样测定。结果见表3。取未检出赭曲霉毒素A 的补骨脂样品5 份，分别加1 000 ng/mL 的赭曲霉毒素A 对照品溶液125 μL，依法进样测定。结果见表2 和表3。

表2 白术加样回收试验结果( n=3)

表3 补骨脂加样回收试验结果(n=5)

2.5 样品含量测定

按拟订方法测定白花蛇舌草、百合、白术、白芷(2 批)、柏子仁(2 批)、薄荷、补骨脂(2 批)等样品中赭曲霉毒素A 的含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果(μg/kg)

3 讨论

流动相选择:选择乙腈-水时，赭曲霉毒素A 峰峰形不尖锐且变形，考虑是赭曲霉毒素A 的解离问题;选择乙腈-水-冰醋酸时峰形良好;选择甲醇-水-冰醋酸峰形不稳定，甚至不出峰;选择甲醇-水时赭曲霉毒素A 不出峰或峰形极差。因此，本试验中采用乙腈-水-乙酸(49.5 ∶49.5 ∶1.0)为流动相。

供试品溶液前处理优化:由于考察的中药材中有一部分含有大量的脂肪类、油类，这些物质会吸附其他颗粒使之成团，从而把赭曲霉毒素包裹住，无法与免疫亲和柱的特异蛋白充分结合，为了使提取效率、回收效果更好，操作更合理，分别使用高速均质器和大功率超声机对样品溶液进行提取回收试验，先加入80%甲醇后，再加入标准品溶液，以防最后加入80%甲醇而使中药材粉末成团而将标准品溶液中赭曲霉毒素A 吸附进去，造成回收率下降。经多次回收比较发现，多数中药材使用高速均质器和超声提取的回收率均较高且相差不大，而含油脂类较丰富的少数中药材以使用超声机时回收率更高，故使用超声机提取更能广泛应用于中药材的赭曲霉毒素A 检测。赭曲霉毒素A 溶于非极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，试验中经过多次筛选，发现甲醇-水(80 ∶20)作为提取溶剂时提取效果最好，加标回收率在74.6%以上。由于赭曲霉毒素A 在强酸及强碱溶液中易被破坏，经多次试验发现，当溶液pH 为5.6 ～7.1 时赭曲霉毒素A 回收率较高，通过筛选pH 相差较大的中药材进行回收试验，最后得出结论，当加入pH=6.8 的PBS 时，可将补骨脂提取溶液pH 由2.696 调至5.601，此时的回收率均能达到84%以上。

净化条件选择:OchraTest 免疫亲和柱的优点是具有高度的特异性，使用时不需要活化，但上样时有机溶剂的含量应严格控制，甲醇和乙腈等有机溶剂的体积分数不能超过20%，否则会破坏柱体基质，影响赭曲霉毒素A 抗原抗体结合反应。试验中将80%甲醇稀释了5 倍，使其浓度降为16%，然后才过免疫亲和柱，最后用纯甲醇将赭曲霉毒素A 抗原抗体结合位点破坏，使赭曲霉毒素A 脱落流出。

洗脱液选择:试验多次对比使用甲醇、乙腈洗脱后的回收效果，发现使用甲醇的回收率与乙腈相差很小，且甲醇比乙腈便宜，对试验人员的毒副作用较小，故选用甲醇作为赭曲霉毒素A 的洗脱液。

中药材中赭曲霉毒素A 添加范围为2 ～50 ng/g 时，加样回收试验的回收率为64.4% ～106.0%，RSD 为0 ～28.5%。该方法简单可行，结果准确，可用于中药材中赭曲霉毒素A 的检测。

本研究中的免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱法测定中药材中的赭曲霉毒素A，方法简单可行，结果准确，可为我国一直空缺的中药材赭曲霉毒素检测标准提供快速、准确的定性定量检测方法。本方法的适用范围和检测低限基本满足《食品卫生标准》的限量要求，也可满足出入境检验检疫、产品质量监督、工商管理、疾病预防等政府实验室及企业产品质量把关对赭曲霉毒素A 的检测需要。

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