熊果酸灌胃给药大鼠体内药代动力学研究

杨巧虹，蒙明姜，王林丽

(1. 重庆医疗器械质量检验中心，重庆 401147; 2. 中国人民解放军第三军医大学大坪医院药学部，重庆 400042)

熊果酸(UA)又名乌苏酸，为非极性五环三萜酸，系许多中药及其复方制剂的主要成分。熊果酸具有多种生物学活性，尤其在抗肿瘤、保护肝脏、调节中枢神经系统功能、抗病毒和抗菌方面作用显著[1-3]。目前，国内多侧重于其植物化学方面的研究，而国外在其药理学方面的研究较多。本试验中建立了测定熊果酸血药浓度的高效液相色谱(HPLC)法，并对灌胃后的大鼠体内药代动力学进行了研究，现报道如下。

1 仪器、试药与动物

Agilent-1100 型高效液相色谱仪、紫外检测器、泵及柱温箱(美国安捷伦科技公司);AUW 120D 型电子天平(日本岛津公司);XW-80A 型旋涡混合器(上海驰唐电子有限公司);TGL-16G 型台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)。熊果酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110742 -201220);熊果酸提取物(自制，纯度大于95%);乙腈为色谱纯(美国Fisher 公司)，水为二次重蒸水，其余试剂均为分析纯。健康SD 大鼠，体重200 ～250 g，雌雄各半，购自四川大学实验动物中心。试验前适应性喂养1 周。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取熊果酸对照品约20 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀释并定容，摇匀，即得质量浓度为200 μg/mL 的对照品贮备液，置4 ℃冰箱冷藏保存。取熊果酸提取物适量，置25 mL容量瓶中，重蒸水超声混匀得每1 mL 含熊果酸1.0 mg 的混悬液，作为大鼠灌胃液。

2.2 血浆样品预处理

精密量取血浆样品0.1 mL，加入甲醇20 μL，按1 ∶1 加入10%三氯乙酸溶液0.1 mL，旋涡混匀2 min，以1.0×104r/min的转速离心5 min，精密量取上清液20 μL，注入高效液相色谱仪进行分析。

2.3 血药浓度测定方法的建立(HPLC 法)

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(78.5 ∶21.5);检测波长:221 nm;柱温:35 ℃;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL。在上述色谱条件下，测得空白血浆、空白血浆加熊果酸对照品及大鼠灌胃给药1.5 h 后血浆样品的色谱图(图1)。可见，熊果酸保留时间约为12.5 min，血浆中其他杂质不干扰熊果酸的分离和测定，满足检测要求。

2.3.2 方法学考察

标准曲线制备:精密吸取熊果酸对照品贮备液适量，分别用甲醇稀释成系列质量浓度的工作溶液，各取20 μL，加入0.1 mL空白大鼠血浆中，使血浆中药物质量浓度分别为0.05，0.10，1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00 μg/mL，按2.2 项下方法处理，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标、血浆中药物质量浓度(C，μg/mL)为横坐标进行线性回归，得回归方程A=1.656 ×103C+9.63 ×102(r=0.999 5，加权系数1/ C2)。结果表明，熊果酸质量浓度在0.05 ～50.00 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好，定量限为0.05 μg/mL，检测限为15 ng/mL。

图1 高效液相色谱图

方法回收率试验:取空白血浆0.1 mL，分别加入20 μL 不同质量浓度的对照品溶液，得质量浓度分别为0.10，5.00，50.00 μg/mL 的含药血浆，按2.2 项下方法处理，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 方法回收率试验结果(n=6)

提取回收率试验:取空白血浆0.1 mL，分别加入20 μL 不同质量浓度的对照品溶液，得质量浓度为0.10，5.00，50.00 μg/mL的3 个血浆样品，按2.2 项下方法处理，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。取对照品甲醇溶液，在相同条件下直接进样，测定峰面积。以2 种方法测得的峰面积之比计算提取回收率。结果熊果酸平均提取回收率为85.36%，RSD 为6.58%(n=3)。

精密度试验:取已知含熊果酸0.10，5.00，50.00 μg/mL 的对照品溶液，依法处理并进样测定，以1 d 内6 次测定结果计算日内精密度，以1 周内连续3 d 测定结果计算日间精密度。结果日内精密度的RSD 分别为4.25%，3.83%，2.98%(n=6)，日间精密度的RSD 分别为11.28%，9.53%，8.79%(n=3)。

稳定性试验:配制低、中、高(0.10，5.00，50.00 μg/mL)质量浓度的血浆样品数份，分别于不同条件下存放不同时间后，按2.2 项下方法处理，按拟订色谱条件进样测定，计算熊果酸含量，考察样品放置稳定性。结果血浆样品室温下放置4 h、-20 ℃冰箱中冷冻保存7 d、反复冻融3 次后测定值的RSD 值均小于12%，表明3 种条件下样品稳定性均良好，满足样品分析要求。

2.4 药代动力学参数测定

取SD 大鼠10 只，雌雄各半，试验前一晚禁食12 h，不禁水;将熊果酸提取物混悬液按20 mg/kg 灌胃，于给药前及给药后0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，12.00 h时从尾静脉取血约0.3 mL，置肝素化塑料离心管中，分离血浆，置-20 ℃冰箱中保存。按2.2 项下方法处理含药血浆，按拟订色谱条件测定血药浓度。采用DAS 2.1.1 版药动学软件处理数据，并计算药代动力学参数，血药浓度-时间曲线见图2。熊果酸的大鼠体内过程符合一室模型，主要药代动力学参数见表2。

图2 熊果酸均值血药浓度-时间曲线(n=10)

表2 熊果酸灌胃的主要药代动力学参数(n=10)

3 讨论

熊果酸在体外对革兰阳性(G+)菌、革兰阴性(G-)菌和酵母菌均有抗菌活性，具有抗糖尿病、抗溃疡及调节血脂的作用，同时具有抗致癌、抗促癌、诱导F9 畸胎癌细胞分化和抗血管生成作用，还具有明显的抗氧化功能，且对中枢神经系统有明显的安定与降温作用[4]。

本研究结果显示，大鼠单剂量灌胃给予20 mg/kg 熊果酸提取物后，熊果酸的体内过程符合一室模型，约1.0 h 达峰，吸收较迅速;消除半衰期为(4.421 ±1.835)h，消除较慢;中心室分布容积为(5.776 ±1.652)L/kg。目前，关于熊果酸体内过程的研究报道很少，赵国臣等[5]采用HPLC 法测定了小鼠血浆中熊果酸的质量浓度，但仅得到3 个时间点的平均血药浓度。裴丹等[6]研究了龙柴方总萜部位中熊果酸、齐墩果酸在大鼠体内的药代动力学，熊果酸含量为9.4%，体内过程符合二室模型，吸收迅速，体内分布快，表观容积大，消除缓慢，血中药物浓度长时间保持低水平，且有双峰现象，认为可能是由于灌胃的有效部位为中药复方提取物，而复方中的中药配伍对熊果酸的吸收有一定影响。

本研究中，以熊果酸高纯度提取物灌胃给药，考察其在大鼠体内的运行过程，初步阐明了其体内药代动力学过程，为将来口服制剂的处方设计和质量评价奠定了基础。

[1] 王 鹏，张忠义，吴 忠. 熊果酸在药用植物中的分布及药理作用[J]. 中药材，2000，23(11):717 -722.

[2] 杨新河，吕帮玉，毛清黎. 熊果酸的药理研究进展[J]. 贵阳中医学院学报，2006，28(6):52 -54.

[3] 王 涛，邵敬伟，郭养浩. 熊果酸抗肿瘤作用及其机制研究进展[J].药物生物技术，2008，15(2):148 -151.

[4] 孟艳秋，陈 瑜，王 趱，等. 熊果酸的研究进展[J]. 中国新药杂志，2007，16(1):25 -28.

[5] 赵国臣，朱仲玲，张春艳，等. 高效液相色谱法测定小鼠血浆中熊果酸的浓度[J]. 中国医院药学杂志，2007，27(12):1 782 -1 783.

[6] 裴 丹，欧阳臻，赵 明，等. 龙柴方总萜部位中熊果酸、齐墩果酸在大鼠体内的药动学研究[J]. 中国新药与临床药理，2013，24(3):267-271.