氟化钠护齿涂剂的体外细胞毒性和家兔皮肤刺激性研究

党 欢，王 济，王鹏远，王晓娟（第四军医大学口腔医院药剂科，军事口腔医学国家重点实验室，西安 710032）

氟化钠护齿涂剂的体外细胞毒性和家兔皮肤刺激性研究

党 欢，王 济，王鹏远，王晓娟＊（第四军医大学口腔医院药剂科，军事口腔医学国家重点实验室，西安 710032）

目的 氟化钠护齿涂剂是用于口腔龋齿预防的制剂，本文对其体外细胞毒和对家兔皮肤的刺激性进行了评价。方法 遵照GB／T 16886.5－2003《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性实验》中华人民共和国国家标准的实验原则，采用滤膜扩散法进行氟化钠护齿涂剂的体外细胞毒性评价；遵照GB／T 16886.10－2005《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应实验》，采用家兔对氟化钠护齿涂剂进行皮肤刺激性评价。结果 体外细胞毒性实验结果显示，氟化钠护齿涂剂细胞毒性为1级，具有轻度细胞毒性；对家兔皮肤无明显刺激。结论 氟化钠护齿涂剂具有相对较低的毒性，可用于口腔龋齿的预防。

氟化钠护齿涂剂；滤膜扩散实验；细胞毒性；刺激性

龋齿是一种严重影响人类口腔健康的常见病和多发病，尤其是少年儿童的龋病发生率正在逐年上升。在国内由于经济条件不佳及意识缺乏等原因，大部分龋齿得不到有效地治疗，而在西方国家近年来龋齿的发病率已有了大幅下降。氟化物的应用被认为是多数发达国家和地区龋病明显降低的重要原因［1］。在世界卫生组织和口腔界权威机构的推荐下，目前已有多种氟化物防龋技术在世界范围内被广泛应用，并取得了巨大的社会效益和经济效益［2］。氟保护剂是局部用氟防龋的方法之一，具有浓度低、操作简便、使用安全、高效、病人易于接受等优点，在国内外得到越来越多地关注和应用［2－3］。

氟化钠护齿涂剂的有效成分氟化钠是一种用于龋齿前的材料，当把本品涂抹在牙齿上时，能够在牙齿表面形成一层薄膜，进而形成一个持久的氟化钙保护层，使附着在牙釉质上的氟化钠小球在几个月内持续分解释放氟且渗透至牙齿深部，为牙齿提供长期抵抗龋齿的保护。此外，氟化钠能抑制某些口腔致病菌包括对变形链球菌葡萄糖的摄取、转化和利用，从而影响胞外多糖的合成、胞内多糖的贮存，干扰细菌和菌斑在牙面上的堆积和黏附［4］。

本实验拟通过体外细胞毒性实验检测氟化钠护齿涂剂间接接触哺乳类细胞后其生物学反应，通过动物实验观察动物长时间外敷氟化钠护齿涂剂后，是否有局部不良反应的发生，以期为临床广泛应用提供借鉴和指导。

1 仪器与材料

1.1 仪器 超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；二氧化碳恒温培养箱（Thermo Electron公司）；数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；倒置光学显微镜（美国Nikon公司）；直径约45mm孔径0.45μm的醋酸纤维素滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；直径60mm的组织培养皿（上海科兴商贸有限公司）。

1.2 试药 氟化钠护齿涂剂，注册证号：陕食药监械（准）字2009第2630139；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；胰蛋白酶和青链霉素混合液购自北京Solarbio公司；营养琼脂培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；琥珀酸脱氢酶染色液购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.3 细胞系 小鼠成纤维细胞L929购自第四军医大学组织工程中心。

2 实验方法

2.1 滤膜扩散法测氟化钠护齿涂剂体外细胞毒性滤膜扩散法测细胞毒性实验是通过体外培养小鼠成纤维细胞ATCC CCL（NCTC clone 929），用于细胞毒性定性评价的一种方法，具有准确、灵敏的特点。本实验是将护齿涂剂通过醋酸纤维素滤膜与特定的细胞系接触，检测其非特异性细胞毒性，评价其对细胞的毒性作用程度。

2.2 培养基、样品及对照材料的制备 琼脂培养基的配制：将已灭菌的琼脂在水浴中加热至100℃，冷却至48℃。将一份琼脂与一份新配制的预热至48℃的2×生长培养基（含有2×抗生素和体积分数20%小牛血清）混合，使琼脂培养基的最终浓度为1 ×生长培养基。

浸提液制备：浸提介质含体积分数10%血清的细胞培养液。浸提比例：每0.1g样品加1mL浸提介质。浸提条件：37℃，24h。实验样品：吸取0.1 mL浸提液，置于直径约5mm的医用明胶海绵载体上。阴性对照：选用直径约5mm、厚约1mm的高密度聚乙烯圆片，样本表面光滑；阳性对照：选用直径约5 mm、体积分数20%的苯酚溶液浸湿的滤纸片，样本表面光滑；空白对照：含单层细胞但无实验材料的滤膜。

2.3 实验步骤

①细胞生长至对数期末，用培养基配成2.5× 105／mL悬液。

②培养皿底部放置灭菌的醋酸纤维素膜（孔径0.45μm，无表面活性剂），吸取混合均匀的细胞悬液6mL，水平转动培养皿使细胞均匀分散。另一皿加不含细胞的培养液6mL作空白对照。置于37±2℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养24h。

③吸取保存在48℃新制备的琼脂培养基5mL于足够数量新的空培养皿，并在室温使其凝固。

④从经过24h培养含醋酸纤维素滤膜的平皿中吸除多余的培养液，用37±2℃的磷酸盐缓冲液清洗滤膜。取出滤膜，放于琼脂培养基表面，细胞面朝下。

⑤在每一平皿的滤膜上放4个试样（其中试样组放置3个样品及1个阴性对照），置于37±2℃、体积分数5%的CO2培养箱中继续孵育24h（应保证试样与滤膜表面紧密接触）。培养24h后评价细胞毒性。

⑥ 孵育后，去除试样，轻轻将滤膜与琼脂分开，取出滤膜。

⑦用琥珀酸脱氢酶染色液浸泡滤膜，37℃下培养3h。

⑧用100ml·L－1中性甲醛溶液浸泡15min，以固定细胞。用蒸馏水冲洗滤膜，空气中干燥。

2.4 滤膜扩散法细胞毒性评价 结果见表1。

表1 滤膜扩散法实验结果与细胞毒性分级的关系Tab.1 Relation about filter membrane diffusion result and cell cytotoxicity grade

2.5 家兔皮肤刺激性实验 本实验采用家兔皮肤局部给药，观察受试皮肤长时间接触氟化钠护齿涂剂所产生的不良反应。该动物实验通过第四军医大学动物伦理委员会认证审核通过。

2.5.1 实验动物 新西兰大白兔3只，由第四军医大学实验动物中心提供，雄性，体质量控制在2.5～3.0kg，一级动物，许可证号为SCXK－（军）2012－0007。实验前将3只实验用兔置于实验动物房环境中喂养3d以适应环境，给予同质同量饮水。

2.5.2 给药方法 进行实验前1d，分别将3只实验兔背部脊柱两侧去毛、备皮，面积均为5cm×15cm。取氟化钠护齿涂剂约5g，以鸡蛋清适量调匀，均匀涂抹在每只兔脊柱一侧前部的皮肤上，后部涂鸡蛋清作为对照。在每只兔脊柱的另一侧前部的皮肤上涂鸡蛋清作为对照，后部涂以鸡蛋清调匀的氟化钠护齿涂剂。每天涂抹1次，保持4h，连续涂抹14d。从第2天开始，每次涂药前均先剪毛，对照区和实验区同样处理。

2.5.3 家兔皮肤刺激性实验结果评价 受试动物涂药后4h，以温热9g·L－1氯化钠溶液清洗对照区和实验区，静置实验兔1h，肉眼观察对照区和实验区的皮肤改变。根据表2皮肤刺激反应评分，计算各只动物每天的最高积分。

表2 皮肤刺激反应评分Tab.2 Skin irritation scores

按以下公式计算各只动物每天平均积分，按表3判定皮肤刺激强度。

表3 皮肤刺激强度分级Tab.3 Skin irritation intensity grade

2.5.4 统计学方法 收集实验数据后，均以建立数据库形式，录入统计软件SPSS 16.0，计量资料采用Student－t检验。假设检验水准α＝0.05。

3 实验结果

3.1 体外细胞毒性实验 阳性对照组细胞毒性反应为3级，重度细胞毒性；空白对照组细胞毒性反应为0级，无细胞毒性；阴性对照组细胞毒性反应为0级，无细胞毒性；阳性对照组、空白对照组和阴性对照组的反应符合规定，本实验成立。实验样品组细胞毒性反应为1级，轻度细胞毒性。见图1。

图1 滤膜扩散法测氟化钠护齿涂剂细胞毒性琥珀酸脱氢酶染色前后A.阳性对照；B.空白对照；C.阴性对照；D.样品Fig.1 The cytotoxicity of Sodium Fluoride Varnishes tested by a filter membrane diffusion assay before and after succinate dehydrogenase dyedA.positive control；B.blank control；C.negative control；D.sample

3.2 家兔皮肤刺激性实验 结果见表4。实验结果表明，氟化钠护齿涂剂涂敷于家兔背部4h／次，连续2周，无1只出现水肿。每只动物实验区总积分为0.429±0.242，每只动物每天积分为0.031±0.017，而对照区分别为0.333±0.346和0.024±0.025，两者比较差异均无统计学意义，说明氟化钠护齿涂剂局部较长时间涂敷对实验动物皮肤无明显刺激。

表4 氟化钠护齿涂剂对家兔皮肤长时间刺激性实验评分Tab.4 Rabbits skin irritation test scores of Sodium Fluoride Varnishes

4 讨论

龋齿是在以细菌为主的多因素影响下，牙齿硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。儿童龋齿是常见的儿童口腔疾病，病变主要以牙齿脱矿为主。菌斑中未解离的乙酸与乳酸形成H＋的储备库，H＋可使Ca2＋自晶格内移走，导致牙齿硬组织脱矿［5］。

氟保护剂是浓度较低的含氟涂剂之一，适合各年龄段的龋齿预防，是世界卫生组织（WHO）推荐的儿童群体防龋的适宜技术之一［6］。它不仅能够减少牙釉质脱矿［7］，增加牙釉质的再矿化［8］，牙釉质表面高浓度的氟也可导致氟化钙的沉积，增加牙釉质的表面硬度，提高牙齿的抗腐蚀能力［9］；同时沉积的氟化钙可以在牙釉质－菌斑界面缓慢溶解并持续释放氟离子，还能够有效地抑制口腔唾液变形链球菌的生长和代谢，抑制并减少牙菌斑的形成［10］。

氟保护剂具有较高的安全性。Murray J J等［11］通过动物实验证明了氟保护剂安全可靠、不良反应少。本实验通过体外细胞毒性实验和家兔的皮肤刺激实验［12－15］也证明了其较高的安全性。本实验采用医疗器械生物学评价国家标准中推荐的间接细胞毒性测定法即滤膜扩散法［16］来进行氟化钠护齿涂剂的体外细胞毒性评价，操作简便，稳定可靠。

目前，我国关于氟保护剂方面的研究报告仍然较少，临床使用范围局限，浓度单一，不具有代表性，并且都是由专业人员负责完成涂氟工作。期待随着科学研究及临床研究的深入，氟保护剂能深入到社区和学校等范围内进行大规模的推广使用，从而有效降低我国少年儿童龋病的发生率。

［1］Wong M C，Schwarz E，Lo E C.Patterns of dental caries severity in Chinese kindergarten children［J］.Community Dent Oral Epidemiol，1997，25（5）：343－347.

［2］Beltran－Aguilar E D，Goldstein J W，Lockwood S A.Fluoride varnish：a review of their clinical use，cariostatic mechanism，efficacy and safety［J］.J Am Dent Assoc，2000，131（5）：589－596.

［3］唐莉红，袁爽，施乐.氟保护漆预防龋齿研究进展［J］.上海预防医学，2013，25（7）：413－414.

［4］卞金有.口腔预防医学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2001：110－112.

［5］Autio－Gold J T，Courts F.Assessing the effect of fluoride varnish on early enamel carious lesions in the primary dentition［J］.J Am Dent Assoc，2001，132（9）：1247－1253.

［6］Bawden J W.Fluoride varnish：a useful new tool for public health dentistry［J］.J Public Health Dent，1998，58（4）：266－269.

［7］Hu W，Featherstone J D.Prevention of enamel demineralization：an in－vitro study using light－cured filled sealant［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2005，128（5）：592－600.

［8］Sawyer K K，Donly K J.Remineralization effects of a sodium fluoride bioerodible gel［J］.Am J Dent，2004，17（4）：245－248.

［9］Munshi A K，Reddy N N，Shetty V.A comparative evaluation of three fluoride varnishes：an in－vitro study［J］.J Indian Soc Pedod Prev Dent，2001，19（3）：92－102.

［10］Johnson G，Almqvist H.Non－invasive management of superficial root caries lesions in disabled and infirm patients［J］.Gerodontology，2003，20（1）：9－14.

［11］Murray J J，Rugg－gumn A J.Fluorides in caries prevention［D］.Oxford OUP，2003，3：187－192.

［12］Hoang－Dao B T，Tu H H，Hung L T，et al.Evaluation of a natural resin－based new material（Shellac F），as a potential desensitizing agent［J］.Dental material，2008，24：1001－1007.

［13］胡志飞，李勤，李鹏.中药美肤散对家兔皮肤刺激性实验报告［J］.西南国防医药，2013，23（7）：785－786.

［14］王坚成，刘晓岩，吕万良，等.新型阿霉素抗耐药性隐形脂质体的体外细胞毒和体内毒性研究［J］.药学学报，2005，40（5）：475－480.

［15］李得堂，唐洪梅，蔡庆群，等.疗筋涂膜剂的皮肤给药安全性评价［J］.西北药学杂志，2011，26（2）：118－120.

［16］王昕，施燕平，朱雪涛.滤膜扩散法测试齿科美白剂的细胞毒性［J］.齐鲁药事，2006，25（2）：99－100.

In vitro cytotoxicity and rabbit skin irritation of Sodium Fluoride Varnishes

DANG Huan，WANG Ji，WANG Pengyuan，WANG Xiaojuan＊（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Pharmacy，Stomatology Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China）

Objective Sodium Fluoride Varnish was used for caries prevention.Its cytotoxicity in vitro and rabbit skin irritation were evaluated in this study.Methods According to the experimental principle of national biological appraising standard on medical apparatus，the in vitro cytotoxicity was tested by a filter membrane diffusion method and the safety of Sodium Fluoride Varnish was evaluated by rabbit skin irritation test.Results Sodium Fluoride varnish had mild cell toxicity and no obvious skin irritation was observed on rabbits.Conclusion Sodium Fluoride Varnish had a relatively low toxicity and was appropriate for caries prevention.

Sodium Fluoride Varnishes；filter membrane diffusion test；in vitro cytotoxicity；irritation

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.019

R965

A

1004－2407（2015）04－0386－04

2015－03－10）

党欢，女，硕士研究生

＊通信作者：王晓娟，女，主任药师，教授，硕士生导师