微量法在蚯蚓粗提物蛋白质量浓度和蚓激酶活性测定中的应用

范世光，顾鹏毅，赵蔓嘉，汪佳慧，张潇木，刘国栋，梁再赋，孙晋民（中国医科大学实验技术中心一部暨国家中医药管理局中药生物工程实验室Ⅲ级，沈阳 110001）

微量法在蚯蚓粗提物蛋白质量浓度和蚓激酶活性测定中的应用

范世光，顾鹏毅，赵蔓嘉，汪佳慧，张潇木，刘国栋，梁再赋，孙晋民＊（中国医科大学实验技术中心一部暨国家中医药管理局中药生物工程实验室Ⅲ级，沈阳 110001）

目的 探讨微孔板酶联比色测定法在蚯蚓粗提物蛋白质量浓度、蚓激酶活性测定中的应用。方法 蛋白质量浓度采用改良Lowry法，蚓激酶活性采用TAME法，分别使用常量体积和微量体积，用紫外－可见分光光度计和酶标检测仪进行测量，用SPSS软件进行直线拟合，做出标准曲线，比较测量结果。结果 标准曲线截距RSD＜5%，用标准曲线检测BSA的结果显示，2种质量浓度、2种方法的回收率分别为99.6%，94.6%，101.2%和96.5%，RSD分别为3.30%，5.05%，3.36%和2.59%，经t检验3种检测结果差异无统计学意义，可以认为2种检测方法测得的数据一致。结论 可以采用微量法进行蚯蚓粗提物蛋白质量浓度、蚓激酶活性的测定。

蛋白质量浓度；蚓激酶活性；微量法；常量法

地龙又称蚯蚓，是我国传统的中药材之一。因其广泛的药理作用，可用于治疗多种疾病。目前，已从地龙体内提取了多种具有生物活性的物质，如蚓激酶、纤维蛋白溶解酶、地龙免疫活性肽、过氧化物歧化酶、金属硫蛋白及抗肿瘤成分、糖脂蛋白G－90等［14］。在对蚯蚓活性物质的提取工艺研究中，往往采用正交设计和响应面设计，样品相对较多，用常规方法操作时间较长，且试剂消耗较多，尤其在一些微量样品的操作中尤为不便，因此，我们采用微量法代替常量法，以期在较短时间内获得大量实验数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高速匀浆机（WARING 24CB9EC）；高速冷冻离心机（HITACHI himac CR21GⅡ）；紫外－可见分光光度计（SHIMADZU UV－1601）；酶标检测仪（TECAN infinite200PRO）等。

1.2 试药 鲜蚯蚓（辽中）；Lowry蛋白试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141017）；BSA（Solarbio）；对甲基苯磺酰－L－精氨酸甲酯（TAME，上海生物制品研究所）；碱性羟胺、氯化铁（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 样品制备 将所购买的新鲜蚯蚓洗净，每个样品称取20g，加磷酸盐缓冲液20mL，匀浆，中速18 300r·min－1×30s；2次，高速20 000r·min－1×30s；2次，每个样品取2mL，以10 000r·min－1离心30min，收集上清。

2.2 蛋白含量测定 样品用磷酸盐缓冲液200～400倍稀释，紫外－可见分光光度计及酶标仪选用波长620nm。常量法测定按试剂盒说明书操作，反应体系1.3mL。微量法按表1在96孔板中进行操作，反应体系260μL。

2.3 蚓激酶酶活性测定 样品用磷酸盐缓冲液10～100倍稀释，紫外－可见分光光度计及酶标仪选用波长492nm。常量法测定按表2进行，反应体系6 mL，样品取0.5mL＋Tris－HCl 0.5mL＋TAME 1 mL。微量法按表3在96孔板中进行操作，反应体系300μL，样品取25μL＋Tris－HCl 25μL＋TAME 50μL。

表1 微量法蛋白含量标准曲线与样品测定方法Tab.1 Standard curve and sample measuring of trace method for protein determination μL

表2 常量法蚓激酶活性标准曲线与样品测定方法Tab.2 Standard curve and sample measuring for lumbrokinase activity by constant method mL

表3 微量法蚓激酶活性标准曲线与样品测定方法Tab.3 Standard curve and sample measuring of lumbrokinase of trace method μL

每分钟水解1μmol的蚓激酶量为1个TAME活力单位。

2.4 统计学处理 数据处理采用SPSS19.0软件，进行相关分析、直线拟合和t检验。

3 结果

3.1 标准曲线的建立 常量法蛋白含量标准曲线：Y＝1.021 X＋0.006 9（r＝0.998 6），微量法蛋白含量标准曲线：Y＝0.951 8 X＋0.004 4（r＝0.998 5）。常量法TAME标准曲线：Y＝0.103 9 X＋0.025 1（r＝0.996 4），常量法TAME标准曲线：Y＝2.221 X＋0.010 8（r＝0.999 4）。

3.2 标准曲线的验证

3.2.1 标准曲线截距的分析 常量法蛋白含量标准曲线截距为0.006 8±0.002，RSD为0.17%，微量法蛋白含量标准曲线截距为0.004 4±0.011，RSD为0.96%；常量法TAME标准曲线截距为0.025 1± 0.051，RSD为2.11%，微量法TAME标准曲线截距为0.010 8±0.043，RSD为1.99%。

3.2.2 准确度与回收率 配制0.05和0.20 mg·mL－1的BSA溶液，用常量法和微量法测得结果，见表4，结果显示2种方法具有较高的回收率，该方法具有良好的准确度。

3.2.3 精密度 2种方法的变异系数均较小，说明2种方法测定结果有较好的重复性，见表4。

表4 2种方法检测不同质量浓度BSA的结果Tab.4 The results of the different concentrations BSA determination by the two methods （n＝5）

3.3 蚯蚓粗提物的蛋白质量浓度和蚓激酶酶活性测定 蚯蚓粗提物蛋白质量浓度、蚓激酶活性测量结果的分析，随机取2份样品，重复测量3次，用2种方法分别进行蛋白质量浓度和蚓激酶活性检测，见表5，经t检验，尚不能认为2种检测方法结果不同（P＞0.05）［5］。

表5 测定结果的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of the measured results

4 讨论

比色测定法又称分光光度法，是测定生化物质含量的常用方法，也是传统生物化学实验中非常重要的实验技术。标准曲线的制作在比色测定法中具有非常重要的作用［6］。蛋白质含量的测定是生物医学实验中最常用的实验方法之一。目前常用的技术有改良Lowry法、Bradford法和紫外－可见分光光度法，操作虽然简单易行，但各有其不足之处，缺乏可比性［79］。因此，本课题组在对蚯蚓粗提物研究的工作中进行了一些改进，建立了微孔板酶联仪比色测定法。蚓激酶含有多种氨基酸，不仅能直接作用于纤维蛋白，还能使残留在纤维蛋白原中的纤维蛋白溶酶原激活成纤维蛋白溶酶。由于其为蛋白水解酶类，对精氨酸羧端肽有较强的切割作用，故选用底物对甲基苯磺酰－L－精氨酸甲酯（TAME）测定法［10］。

蚯蚓提取物有效成分常是蛋白质和大量多肽的混合物，所以在进行蚯蚓提取物中蛋白质含量测定时，为了能够更加精确、真实地反映出其蛋白质的量，应该使用改良Lowry法。同时，对于其他的生物供试品在蛋白质含量测定方法选择时具有一定的参考价值［11－12］。

微孔板法有如下优点：（1）样本、试剂用量少；（2）检测大批量样本时，大大地减少了操作时间；（3）利用自动酶标仪一次性读取各孔光密度，缩短了检测时间。我们认为该方法重复性好、测量结果准确、操作简便快速，是值得推广应用的实验方法。

［1］Hwan Cho，Eui Sung Choi，Hun Gil Lim，et al.Purification and characterization of six fibrinolytic serine－proteases from Earthworm Lumbricus rubellus［J］.2004，37（2）：199－205.

［2］Yung－Ming Chang，Wei－Yi Chi，Tung－Yuan Lai，et al.Dilong：role in peripheral nerve regeneration［J］.2011，2011：380809.

［3］Edwin L Cooper，Mariappan Balamurugan，Chih－Yang

Huang，et al.Earthworms Dilong：ancient，inexpen－sive，noncontroversial models may help clarify approaches to integrated medicine emphasizing neuroimmune systems［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：164152.

［4］滕文娇，孙晋民.蚓激酶的药学与临床研究进展［J］.西北药学杂志，2011，26（1）：69－72.

［5］杨范莉，宋立强.HPLC法同时测定黄芪中4种成分的含量［J］.西北药学杂志，2012，27（6）：526－527.

［6］杨泽民，罗少洪，李明.关于比色测定法中标准曲线制作的思考［J］.中医药导报，2012，18（5）：78－80.

［7］薛辉，颜光涛，林季.微孔板比色测定法在微量蛋白测定中的意义［J］.国际检验医学杂志，2007，28（5）：399－401.

［8］李海玲，彭书明，李凛，等.4种常用蛋白浓度测定方法的比较［J］.中国生化药物杂志，2008，29（4）：277－278，282.

［9］闫萍，牛勃，张悦红，等.蚯蚓提取物中蛋白质含量测定方法的研究［J］.中国生化药物杂志，2007，28（1）：27－29.

［10］郝苏丽，张林可，徐康森.以TAME为底物测定蚓激酶效价［J］.药物分析杂志，1995，15（3）：39－41.

［11］贺葵邦，王英姿，张春泥，等.正交实验优选地龙水提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：33－35.

［12］陈国梅.总磷测定中标准曲线与工作曲线的比较［J］.福建分析测试，2009，19（1）：76－77，82.

Application of trace method in the determination of earthworm crude protein concentration and earthworm kinase activity

FAN Shiguang，GU Pengyi，ZHAO Manjia，WANG Jiahui，ZHANG Xiaomu，LIU Guodong，LIANG Zaifu，SUN Jinmin＊
（The Center of Laboratory Technology and Experimental Medicine，China Medical University，State Administration of Traditional Chinese Medicine Biological Engineering Research Laboratory GradeⅢ，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate and compare the application of microplate enzyme－linked colorimetric assay in protein concentration determination，and the kinase activity in earthworm crude extracts.Methods The protein concentration was determined by using the improved Lowry method，and the kinase activity was determined by using the TAME method.The constant volume and micro volume were tested respectively，in UV－VIS spectrophotometer or enzyme measurement standard detector.SPSS softwarewas used to make the standard curve.Results The standard curve intercept RSD was less than 5%.Two concentration curves was used for BSA detection.The recovery of the two methods were 99.6%，94.6%，101.2%and 96.5%，respectivly，and RSD were 3.30%，5.05%，3.36%and 2.59%，respectivly.No statistical significance was observed.Conclusion The microplate assay method could be used for the protein concentration and the kinase activity determination.

protein concentration；lumbrokinase activity；trace method；constant method

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.002

R284

A

1004－2407（2015）04－0334－04

2015－03－02）

辽宁省科技厅课题项目（编号：2013225021）；辽宁省科技厅课题项目（编号：2008225021－1）

范世光，男，助理实验师

＊通信作者：孙晋民，女，教授，硕士生导师