不同工艺制备延胡索提取物的FTIR谱图特征分析

王 媚，史亚军，年娟娟，王雍卿，刘 力（陕西中医学院药学院中药制药重点学科，咸阳 712046）

不同工艺制备延胡索提取物的FTIR谱图特征分析

王 媚，史亚军＊，年娟娟，王雍卿，刘 力（陕西中医学院药学院中药制药重点学科，咸阳 712046）

目的 考察延胡索不同提取物粉末的红外光谱学特征，建立延胡索提取物的质量检测方法，为中药提取物的实时质量监控提供参考。方法 以延胡索乙素为指标，采用HPLC测定其含量；利用傅里叶变换红外光谱技术（FTIR）对延胡索药材及其不同提取物进行研究。结果 延胡索药材及其提取物有着各自稳定的红外光谱指纹特征，图谱中位于1 610，1 520和1 457cm－1处的振动峰是判断延胡索乙素在不同提取物样品中含量高低的主要依据，而其测定结果与HPLC的结果基本吻合。结论 该方法简便、快速，能够准确地提供中药提取物中主要化学成分的相关信息，为制定下一步的提取方案提供方向性参考。

延胡索；延胡索乙素；中药提取物；傅里叶变换红外光谱法

延胡索为罂栗科植物Rhizoma corydalis W.T.Wang的干燥块茎，具有活血、止痛之功效，临床主要用于治疗各种疼痛等［1］。延胡索中的延胡索乙素等叔胺类生物碱是其作用的主要物质基础，常用液相色谱、毛细管电泳等方法来测定药材提取物中延胡索乙素的含量［2－6］。这种以测定某一种有效成分或指标成分为目标的分析方法，从中医药的多组分整合调节作用的观点看，这些指标成分的控制难以真正控制中药功效。傅里叶变换红外光谱（FTIR）法具有取样量小、简便迅速、准确等优点，且无需样品分离提取，不破坏样品的原本性，即可获得药材的宏观整体信息。因此，它可用于作为评价中药质量的一项关键指标。已有报道将红外光谱技术应用于中药材质量控制方面的研究［7－15］。

本文以延胡索为研究对象，通过对其药材和不同提取物粉末样品红外光谱的分析比较，建立无损、快速地测定延胡索不同工艺提取物的红外分析方法，为制定下一步提取方案和检测方法提供方向性参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 TENSOR－27型傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克公司）；BT25S型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；769YP－15A型粉末压片机（上海新诺仪器设备有限公司）；玛瑙研钵。

1.2 试药 延胡索购自西安盛兴中药饮品有限责任公司；延胡索对照药材和延胡索乙素对照品均购自中国药品生物制品检定所；溴化钾为光谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：2013923）；甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为二次去离子水。实验中药材样品经陕西中医学院药学院王西芳教授鉴定。

2 方法

2.1 样品提取

2.1.1 药典法提取 分别取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）约2g，精密称定，置于平底烧瓶中，精密加入浓氨试液－甲醇（1∶20）混合溶液200mL，称定质量，冷浸1h后加热回流1h，放冷，再称定质量，用浓氨试液－甲醇（1∶20）混合溶液补足减失的量，摇匀，滤过，备用。平行制样3份。

2.1.2 索氏法提取 分别取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）约2g，精密称定，置于索氏提取器中，精密加入体积分数80%乙醇溶液200mL，水浴回流提取5h，滤过，备用。平行制样3份。

2.1.3 超声法提取 分别取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）约2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数80%乙醇溶液200mL，称定质量，超声处理1h，放冷，再称定质量，用体积分数80%乙醇溶液补足减失的量，摇匀，滤过，备用。平行制样3份。

2.1.4 回流法提取 分别取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）约2g，精密称定，置于平底烧瓶中，精密加入体积分数80%乙醇溶液200mL，水浴回流提取2次，第1次2h，第2次1h，滤过，合并2次滤液，减压浓缩至200mL，摇匀，备用。平行制样3份。

2.2 红外样品制备 分别取上述提取液适量在水浴上蒸干，得粉末样品。再分别精密称取上述4种提取物粉末、药材及化学对照品粉末与KBr按照300∶1（使其最强吸收峰的透射率在10%以下）的比例混合，在红外灯下混合后充分研磨均匀，放入模具内，作用2min，压强为9.81×108Pa，取出，得直径13mm、厚度为0.5mm左右的供试片，立即放入样品架进行测定。

2.3 样品测定及图谱处理 采用TENSOR－27型傅里叶变换红外光谱仪，设定扫描累加次数16次，分辨率为4cm－1，将压好的供试片在4 000～400cm－1光谱范围内进行扫描测定，并实时扣除H2O和CO2干扰；将得到的各个样品的红外光谱图，对其分别进行基线校正、平滑等处理，保存处理后的谱图即可。

3 结果

3.1 HPLC测定延胡索乙素含量

3.1.1 色谱条件 Agilent C18（250mm×4.6mm，5 μm）；以甲醇1mL·L－1磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.0）（55∶45）为流动相；流速1.0mL·min－1，检测波长为280nm，柱温为30oC。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000［1］。

3.1.2 对照品溶液的制备 取延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含102μg的溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

3.1.3 供试品溶液的制备 分别精密量取2.1项下各续滤液50mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

3.1.4 标准曲线的制备 取延胡索乙素对照品适量，精密称定，置于10mL的量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，得质量浓度为146μg·mL－1的标准储备液，再逐级稀释成质量浓度为20，40，60，80，100和120μg·mL－1的系列标准液。分别吸取上述溶液各20μL按上述色谱条件注入色谱仪，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标（Y）、对照品质量浓度（μg·mL－1）为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程：Y＝24.708 X－55.333，相关系数r＝1.000 0。延胡索乙素的进样质量浓度在20～120μg·mL－1范围内，其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

3.1.5 精密度实验 精密吸取300目药典法提取的供试品溶液，在3.1.1色谱条件下，连续进样5次，记录峰面积。结果提取液的RSD为0.297%，结果表明仪器精密度良好。

3.1.6 稳定性实验 精密吸取同一300目药典法提取的供试品溶液，分别于0，4和8h，按照3.1.1色谱条件测定其不同时间的峰面积，RSD为0.77%，说明供试品溶液在8h内稳定性良好。

3.1.7 重复性实验 取同一300目样品6份，按照2.1.1项下的方法制样，在3.1.1色谱条件下进行分析，共测定6次，结果延胡索乙素含量的平均值为0.192 1%，RSD为1.21%，n＝6。表明重复性较好。

3.1.8 加样回收率实验 精密称取供试品溶液6份，分别精密加入延胡索乙素对照品溶液5.2，6.5，和7.8mL，测定样品中的含量，计算回收率。结果延胡索乙素的平均回收率为98.031%，RSD为1.28%，结果表明本法回收率良好。

3.1.9 含量测定 取供试品溶液各20μL按上述色谱条件分别注入色谱仪，测定峰面积（Y），将结果代入3.1.4中的回归方程，计算延胡索乙素含量（%），结果见图1和表1。

图1 高效液相色谱图a.回流法样品；b.超声法样品；c.药典法样品；d.索氏法样品；e.延胡索乙素对照品Fig.1 HPLC chromatogramsa.sample by reflux method；b.sample by ultrasound method；c.sample by China Pharmacopoeia method；d.sample by Soxhlet method；e.tetrahydroplmatine reference substance

3.2 延胡索药材和延胡索乙素对照品的红外光谱图分析 延胡索的有效成分是生物碱，延胡索乙素为其中最主要的成分。图2为延胡索乙素对照品和延胡索对照药材的红外光谱图。由图2可看出，虽然在1 200～800cm－1延胡索图谱的峰重叠较为严重，但是在1 651，1 517，1 456，1 420，1 372和1 240cm－1波段的特征峰表现出了延胡索乙素的1 610，1 520，1 457，1 427，1 391和1 230cm－1指纹特征峰；另外，延胡索的阶梯峰1 156，1 080和1 022cm－1与延胡索乙素的1 142，1 082和1 029cm－1一一对应。因此，结合红外光谱结构，以1 651，1 517，1 456，1 420，1 372，1 240，1 156，1 080和1 022cm－1可以作为延胡索药材的特征相关峰。其中延胡索乙素在1 610，1 520和1 457cm－1处的峰高作为判断其含量高低的主要依据。

图2 延胡索对照药材和延胡索乙素对照品的红外光谱图1.延胡索对照药材；2.延胡索乙素对照品Fig.2 FTIR spectra of Rhizoma corydalis and tetrahydroplmatine1.Rhizoma corydalis；2.tetrahydroplmatine

3.3 延胡索药材与粗粉延胡索不同提取物的红外光谱图比较 图3显示了延胡索对照药材和不同提取物的红外光谱图。结果显示，4种提取物的红外光谱图在1 632，1 520和1 384cm－1处与药材在1 651，1 517和1 372cm－1处的峰是一一对应的，并且4种提取物的峰位更接近于延胡索乙素对照品的相关特征峰位。与延胡索药材相比，4种提取物中延胡索乙素的含量明显增加，这是由延胡索乙素在1 610，1 520和1 384cm－1处的峰在整体谱图中表现的峰形和峰强决定的。此处的峰在整体谱图中表现的峰越强，峰形越尖，则该提取物中的延胡索乙素的富集程度越高。此外，提取物中的阶梯峰1 156，1 080和1 029 cm－1也能帮助判断延胡索乙素在整个提取物谱图中的含量。

由图3还可以看出，索氏提取法的提取物谱图明显高于药典、超声、回流法的，也高于药材本身的谱图。这充分说明了提取工艺对延胡索药材中的延胡索乙素进行了不同程度的富集，同时也说明了不同的提取方法之间是有差异的。

图3 延胡索对照药材与粗粉延胡索不同提取物的红外光谱图1.索氏法提取；2.药典法提取；3.超声法提取；4.回流法提取；5.延胡索对照药材Fig.3 FTIR spectra of Rhizoma corydalis and its different extracts1.extracts of Soxhlet；2.extracts of China Pharmacopeia；3.extracts of ultrasound；4.extracts of reflux；5.Rhizoma corydalis

3.4 延胡索药材与300目延胡索不同提取物的红外光谱图比较分析 图4显示了延胡索对照药材和300目不同提取物的红外光谱图。图4与图3相似，可以看出，提取物中延胡索乙素的富集程度是：索氏法＞药典法＞回流法＞超声法，也远远高于药材本身的含量。这进一步说明了提取工艺对延胡索药材中的延胡索乙素进行了不同程度的富集。同时，结合表1的数据也可以看出，300目提取物中延胡索乙素的富集效果基本上要高于粗粉中的富集效果，虽然变化规律和平行的以延胡索乙素为指标成分的HPLC实验结果不太吻合，如回流的含量相差较大。说明微观的以单一成分为标准的HPLC测定结果与宏观的红外光谱所反映的整体实验结果是可能吻合的。

从表1可以看出，延胡索超微粉的提取率均大于粗粉。由于索氏提取法提取率高、稳定性好，又考虑实验易实现，建议在对延胡索中延胡索乙素的含量进行测定时，选择粗粉索氏提取法为宜。

图4 延胡索对照药材与300目延胡索不同提取物的红外光谱图1.索氏法提取；2.药典法提取；3.超声法提取；4.回流法提取；5.延胡索对照药材Fig.4 FTIR spectra of Rhizoma corydalis and the different extracts of 300mesh Rhizoma corydalis1.extracts by Soxhlet method；2.extracts by China Pharmacopeia method；3.extracts by ultrasound method；4.extracts of refluxh；5.Rhizoma corydalis

3.5 相关性分析

用不同粉碎度（目）、不同提取物谱图中延胡索乙素的相关特征峰位的峰强与HPLC的测定结果来建立方程。见表1。以1 632和1 384cm－1的峰强数据分别为自变量X1和X2，以HPLC的测定结果为因变量Y，使用统计软件SPSS Statistics Base 17.0，采用向后回归法建立方程。方程如下：Y1＝－1.121 X1＋1.303 X2＋0.118，R21＝0.994，P＜0.05；Y2＝1.115 X1－1.237 X2＋0.060，R22＝0.860，P＜0.05。从结果可看出，不同粉碎度（目）、不同提取物的红外光谱数据与对应的HPLC数据之间呈线性关系，因此具有相关性。

4 讨论

延胡索对照药材和提取物中的每一特征峰能与延胡索乙素对照品的特征峰构成一一对应关系，尽管有一些峰有稍微的位移，但波动较小，相关的峰数较多，表明在延胡索提取物样品中主要成分延胡索乙素富集程度很高，延胡索中延胡索乙素的含量为0.06%［16］，这为红外光谱整体鉴别延胡索取得良好效果奠定了基础。实验中，延胡索4种提取物样品的红外光谱图既有相关性，又有区别。相应的共有特征峰均已在图谱上体现，指纹特征的相关性很好；各提取物的整体谱图明显高于药材的红外谱图，说明该提取物样品中以延胡索为代表的主要成分得到了有效富集；而4种提取物中延胡索乙素的含量又有一定的差别，说明索氏提取对延胡索乙素的富集效果优于药典法、回流法和超声法。因此，通过分析比较药材和不同提取物的红外光谱，可以宏观整体地把握中药各级提取物中的化学信息，从而为下一步化学成分的微观分析提供方向性参考；另外根据红外光谱图提供的化学成分差异信息，可以及时指导中药提取分离工艺的改进和优化。

表1 峰强比和HPLC法测定不同方法提取的延胡索乙素Tab.1 Ratio of peak intensity and HPLC results of tetrahydropalmatine in different methods for extraction

中药的红外光谱是复杂体系的整体红外光谱，具有宏观的指纹特性。中药提取物是对中药的进一步加工，能够对有效成分进行富集；从形态学角度研究中药提取物红外光谱的指纹或特征谱为优化提取工艺提供参考，而不是像确定官能团那样去解析光谱的理论已经开始得到认可［17］，因此，红外光谱可以作为用于评价延胡索提取物质量的一项关键指标。

5 结论

本实验表明，利用傅里叶变换红外光谱技术能够快速、简便地提供延胡索提取物中主要化学成分的定性和半定量信息，并且结合高效液相色谱法对含量进行测定，结果满意。因此，该实验可为制定下一步的提取方案、后续化学成分的分析以及中药提取分离工艺的改进提供有效参考；同时可作为中药提取物质量控制的重要手段之一。

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FTIR analysis of Rhizoma corydalis extracts prepared by different procedures

WANG Mei，SHI Yajun＊，NIAN Juanjuan，WANG Yongqing，LIU Li（Chinese Pharmaceutical Key Discipline and Specialties，College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China）

Objective In order to control the quality of Rhizoma corydalis a novel method was established to measure the traditional Chinese medicine extracts of Rhizoma corydalis，in which the characteristic peaks was investigated by Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）.Methods The content of tetrahydropalmatine was determined by HPLC；The characteristic peaks were recognized and the FTIR spectra of Rhizoma corydalis and its different extracts were compared.Results The FTIR spectra of traditional Chinese medicine extracts of Rhizoma corydalis exhibited macroscopic fingerprint characteristics.The typical and strongest absorption peak in IR spectrum of tetrahydroplmatine was at 1 610，1 520and 1 457cm－1，which was assigned to the vibration band，and its intensities in spectra of different medicinal herb extracts became the main identification standard of the contents of tetrahydroplmatine in those samples.The results of tetrahydroplmatine from different extracting methods were consistent with the results of HPLC.Conclusion The method is simple and rapid，which could provide valuable information about the chemical constituents of medicinal extracts for guiding the next step of extraction and separation improvement.

Rhizoma corydalis；tetrahydroplmatine；medicinal extracts；Fourier transform infrared spectroscopy

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.004

R284

A

1004－2407（2015）04－0340－05

2014－12－04）

陕西省教育厅科研计划资助项目（编号：12JS038）；陕西省重点科技创新团队项目（编号：2013KCT－26）；陕西省科技统筹创新工程计划项目（编号：2011KTCG03－02）

王媚，女，硕士，实验师

＊通信作者：史亚军，男，博士，副教授