响应面法优化超声提取灯心草中去氢厄弗酚的工艺

付 茜，王勤辉，孙 璐，江美芳，黄建梅（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

·中药及天然药物·

响应面法优化超声提取灯心草中去氢厄弗酚的工艺

付 茜，王勤辉，孙 璐，江美芳，黄建梅＊（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

目的 以甲醇为提取溶剂，用超声法从灯心草中提取去氢厄弗酚。方法 以单因素实验为基础，分别考察超声提取时间、超声提取功率、甲醇体积分数对去氢厄弗酚提取率的影响，确定各因素的适宜水平。在此基础上，利用Box－behnken中心组合设计法设计响应面分析甲醇体积分数、超声时间和超声功率3个因素对去氢厄弗酚提取率的影响，建立二次回归方程，分析最佳提取工艺。结果 灯心草中去氢厄弗酚超声提取的最佳工艺为：甲醇体积分数为80.4%，超声时间为40min，超声功率为40%P（P＝400W），在此条件下，去氢厄弗酚提取量达到1.003 0mg·g－1。结论 Box－behnken设计结合响应面分析法操作简单，可以更好地对灯心草中去氢厄弗酚的超声提取工艺进行优化。

灯心草；去氢厄弗酚；响应面分析；超声提取

灯心草（Juncus effusus L.）为灯心草科灯心草属多年生草本植物，入药部位为干燥茎髓，临床主要用于治疗因心火所致的心烦失眠、尿少涩痛、口舌生疮［12］。我国灯心草资源十分丰富，国内外对其成分研究也较为透彻，菲类、黄酮类、三萜类和甘油酯类为其主要化学成分［3－9］。课题组前期研究发现：不同产地灯心草中化学成分相似度很高，且菲类成分为其最主要成分［10］；同时利用成分敲除技术实验证实：菲类成分是灯心草中的抗焦虑活性物质［11］，其中去氢厄弗酚含量最高，为清心除烦的物质基础之一［12－13］。而目前对灯心草中菲类化合物的提取工艺尚未报道，有必要对其提取工艺进行研究。本文先进行单因素实验考察，后采用响应面中心组合方法设计3因素3水平实验，优化灯心草中去氢厄弗酚的超声提取条件，为灯心草中菲类成分的高效提取提供理论依据，也为灯心草的临床前研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC－20A型高效液相色谱仪（SPD－20A检测器，日本岛津公司）；安捷伦HC－C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；KQ3200DE型数控超声提取器（昆山市超声仪器公司）；BL－100多功能高速小型粉碎机（浙江永康五金公司）；CPA225D型Sartorius精密电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药 去氢厄弗酚对照品（实验室自制，质量分数为98.0%）；液相用甲醇为色谱纯（Fisher公司），水为娃哈哈纯净水；超声提取用甲醇为分析纯（北京化工厂）；灯心草髓部采购于江西抚州。

2 方法

2.1 去氢厄弗酚的测定方法

2.1.1 色谱条件 采用课题组前期段琼等［14］的色谱条件：Agilent HC－C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－水（65∶35）；流速为1.0mL·min－1；柱温23℃；检测波长为270nm；进样量为10μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取去氢厄弗酚对照品25.00mg，加适量甲醇使其溶解，转移至250mL量瓶中，用甲醇定容得100mg·L－1的对照品溶液。

2.1.3 样品溶液的制备 取干燥灯心草髓部，粉碎后过60目筛。精确称取0.20g粉末，精密加入20 mL体积分数80%甲醇溶液，超声提取（超声功率为60%P）30min，静置放冷至室温，用体积分数80%甲醇溶液补足损失的质量，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，即得样品溶液。

2.1.4 线性关系考察 分别精密量取配制好的去氢厄弗酚对照品溶液0.1，0.25，0.5，1.5，2.5和10.0 mL，置于10mL量瓶中，定容稀释至刻度，得1.0，2.5 ，5.0，15.0，25.0和100.0μg·mL－1的6份待测溶液。按照上述色谱条件，分别进样测定，以去氢厄弗酚对照品量为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，得到标准曲线：Y＝84 773X＋18 483（r＝0.999 9），表明去氢厄弗酚的质量浓度在1.00～100.00μg·mL－1范围内，线性关系良好。

2.2 单因素实验优化去氢厄弗酚的提取条件 采用2.1项下的方法，固定其他影响因素不变，以去氢厄弗酚的提取率为指标，对甲醇体积分数、超声提取时间、超声提取功率3个因素在一定范围内分别进行考察。

2.3 响应面法优化灯心草中去氢厄弗酚的提取工艺 本实验利用Design－expert V8.0.6.1软件，以中心组合设计原理来设计响应面实验。先以单因素实验结果为依据，在一定范围内选取甲醇体积分数、超声时间和超声功率3个因素作为实验因素进行考察，再以去氢厄弗酚提取率为响应值，由程序设计响应面实验，实验水平和因素见表1。

表1 响应面－中心组合因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box－behnken

3 结果

3.1 单因素实验

3.1.1 甲醇体积分数对去氢厄弗酚提取率的影响每次准确称取灯心草0.20g，分别选择甲醇体积分数50%，60%，70%，80%和90%进行实验，发现灯心草中去氢厄弗酚的提取量随着甲醇体积分数的增加而相应增加，但当甲醇体积分数达到70%时，去氢厄弗酚的量达到最大，且趋于稳定。当甲醇体积分数达到90%时，去氢厄弗酚的量略微下降，可能是与去氢厄弗酚的极性大小有关。故选定甲醇的体积分数为70%左右。

3.1.2 超声提取时间对去氢厄弗酚提取率的影响

每次准确称取灯心草0.20g，分别选择超声时间10，20，30，40和50min进行实验，结果随着超声提取时间的增加，去氢厄弗酚的提取量会增加，当达到30min时，其含量最高，之后，随着超声时间的增加，去氢厄弗酚提取量会稍有减少。可能是由于超声时间过长，造成了目标成分的破坏。故选定超声提取时间在30min左右。

3.1.3 超声提取功率对去氢厄弗酚提取率的影响每次准确称取灯心草0.20g，分别选择超声提取功率40%P，50%P，60%P，70%P和80%P（P＝400W）进行实验，结果去氢厄弗酚的量随着超声功率的增大而稍有增加，到60%P时，提取量达到最大。之后，随着超声功率的增加，去氢厄弗酚的提取量会减少，可能是由于超声功率过大，造成了目标成分去氢厄弗酚的破坏。故选择超声功率在60%P左右比较适合。

3.2 响应面法优化去氢厄弗酚的超声提取条件 响应面－中心组合实验设计的实验具体方案和结果见表2。

表2 响应面－中心组合设计方案与结果Tab.2 Experimental designs and results of Box－behnken

运用响应面法分析上述所得的实验结果，可计算得到以去氢厄弗酚提取量为响应值的回归方程：

Y＝0.91＋0.20A＋0.018B－3.84×10－3C－0.018 AB＋7.86×10－3AC－7.79×10－3BC－0.12 A2＋1.50×10－4B2＋0.021C2

式中：Y表示去氢厄弗酚提取量（mg·g－1），A表示甲醇体积分数，B表示超声时间，C表示超声功率。

回归统计得到分析结果，见表3。由表3可知，以去氢厄弗酚的提取量为响应指标时，模型P＜0.000 1，模型相关系数r＝0.997 4，表明该二次方程模型高度显著，实验设计可靠。失拟项值为0.146 4，即方程模型失拟不显著，说明一些未知因素对提取实验的影响很小。同时，可以得知各个因素对去氢厄弗酚提取率由大到小的影响依次为：甲醇体积分数、超声时间、超声功率，其中对提取率影响最显著的是甲醇体积分数。方差分析的结果表明，方程的总模型、甲醇体积分数（A）及二次项对去氢厄弗酚提取率的影响极其显著；超声时间（B）及甲醇体积分数与超声时间的相互作用（AB）对去氢厄弗酚提取率影响达到显著水平，而交互项AC和BC对去氢厄弗酚提取率的影响不显著。各因素间交互作用的响应面图见图1。

表3 响应面法对去氢厄弗酚提取量的方差分析结果Tab.3 Analysis results of mean square deviation for extracting dehydroeffusol

图1 两因素交互作用对去氢厄弗酚提取量影响的响应面图A.甲醇体积分数与超声时间；B.甲醇体积分数与超声功率；C.超声时间与超声功率Fig.1 Response surface for the effect of extraction rateA.methanol concentration and ultrasonic time；B.methanol concentration and ultrasonic power；C.ultrasonic time and ultrasonic power

综合以上响应面数据分析，Design－expert程序可以预测出对灯心草髓部去氢厄弗酚提取的最优化工艺为：甲醇提取的体积分数为80.4%，超声40 min，超声功率为40%P（P＝400W），在此最佳条件下，去氢厄弗酚的提取量可达到1.006 2mg·g－1。3.3 验证实验 根据响应面优化后的预测条件，即在甲醇的体积分数为80.4%，超声40min，超声功率为40%P（P＝400W）条件下，得到平行实验3次的结果，其平均值为1.003 0mg·g－1，而软件模型对去氢厄弗酚提取量的预测最佳值为1.006 2 mg·g－1，两者误差仅为0.32%，两者十分吻合，说明建立的模型可行。同时，去氢厄弗酚的提取率与单因素实验结果比较，得率较高。

4 讨论

去氢厄弗酚是灯心草清心除烦的物质基础之一，有必要对其进行快速、有效地提取，本实验研究了超声提取灯心草中去氢厄弗酚的工艺，响应面法优化条件结果表明，甲醇体积分数、超声时间对去氢厄弗酚提取率有显著影响，同时可以发现，甲醇体积分数起了决定性的作用，可以考虑固定甲醇的体积分数，使其他影响因素可以在一定范围内变化，从而有效地提取去氢厄弗酚，为灯心草的工业化大生产提供依据。

超声提取具有提取率高、适用性广、耗能少等特点［15］。本文的研究结果也证实，Box－behnken响应面法能快速有效地获得更加优化的提取条件，提供准确的实验数据，方便简单。该法尤其适合于探索性的实验研究，能更为准确地指明实验方向［16］，可为中药活性成分的产业化发展提供理论依据，有较好的应用前景。

参考文献：

［1］吴国芳.中国灯心草属植物的研究 ［J］.植物分类学报，1994，32（5）：433－466.

［2］国家药典委员会.中国药典2010年版［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：137.

［3］Su X H，Yuan Z P，Li Y F，et al.Phenanthrenes from Juncus effusus［J］.Planta Med，2013，79：1447－1452.

［4］Dellagreca M，Fiorentino A，Mangoni L，et al.9，10－Dihydrophenanthrene metabolites from Juncus effusus L.［J］.Tetrahedron Lett，1992，33（36）：5257－5260.

［5］Dellagreca M，Fiorentino A，Mangoni A，et al.A bioactive dihydrodibenzoxepin from Juncus effusus［J］.Phytochemistry，1993，34（4）：1182－1184.

［6］Dellagreca M，Monaco P，Previtera L，et al.Minor bioactive dihydrophenanthrenes fromJuncus effusus［J］.J Nat Prod，1997，60：1265－1268.

［7］Dellagreca M，Fiorentino A，Monaco P，et al.Antialgal phenylpropane glycerides from Juncus effusus［J］.Nat Prod Res，1998，12（4）：263－270.

［8］Shan C Y，Ye Y H，Jiang H F，et al.Study on chemical constituents isolated fromJuncus effuses［J］.J Chin Med Mater，2008，31（3）：374－376.

［9］金东哲，闵知大，孔令义，等.灯心草科植物中二萜成分［J］.国外医药植物药分册，1995，10（5）：208－211.

［10］简伟杰，段琼，黄建梅，等.灯心草药材RP－HPLC指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：60－63.

［11］李贵云，王小红，黄建梅，等.基于成分敲除技术辨识灯心草抗焦虑的主要有效成分［J］.中草药，2014，45（6）：825－827.

［12］Liao J，Zhai H F，Huang J M，et al.Anxiolytic and sedative effects of dehydroeffusol fromJuncus effusus in mice［J］.Planta Med，2010，77（5）：416－420.

［13］Liao Y J，Zhai H F，Huang J M，et al.Phenanthrenes fromJuncus effusus with anxiolytic and sedative activities［J］.Nat Prod Res，2012，26（13）：1234－1239.

［14］段琼，王杨，黄建梅，等.HPLC测定灯心草中去氢厄弗酚含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（20）：92－94.

［15］万水昌，王志祥，乐龙，等.超声提取技术在中药及天然产物提取中的应用［J］.西北药学杂志，2008，23（1）：60－62.

［16］张艳，李勇哲，张扬，等.Box－Behnken设计－响应面法优选平菇中多糖的超声波辅助纤维素酶提取工艺［J］.西北药学杂志，2014，29（1）：1－5.

Optimization of ultrasonic－assisted extraction method of dehydroeffusol fromJuncus effusus by response surface methodology

FU Qian，WANG Qinhui，SUN Lu，JIANG Meifang，HUANG Jianmei＊（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To investigate the ultrasonic－assisted extraction method of dehydroeffusol fromJuncus effusus.Methods The effects of methanol concentration，extraction time，and extraction power were investigated.A 17－run response surface design involving three factors at three levels was generated by the design－expert software and the experimental data obtained were subjected to quadratic regression analysis，and to create a mathematical model describing the dehydroeffusol extraction.Results The optimal ultrasonic－assisted extraction conditions were as follows：methanol volume fraction 80.4%and ultrasound power 40%P（P＝400W）for 40min.Under these optimized conditions，the yield of dehydroeffusol was 1.003 0mg·g－1.Conclusion The Box－behnken design and response surface analysis can optimize the ultrasonic－assisted extraction conditions of dehydroeffusol fromJuncus effusus easily.

Juncus effusus；dehydroeffusol；response surface methodology；ultrasonic assisted extraction

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.001

R284

A

1004－2407（2015）04－0331－04

2015－03－10）

国家自然科学基金资助项目（81173541）

付茜，女，硕士研究生

＊通信作者：黄建梅，女，教授，博士生导师