结合药效学指标用正交实验优选湿迪胶囊的提取工艺

王文静，贺 婧，姜婷婷，李励珺，黄罗生，富志军（中国药科大学中药学院 南京 211198）

结合药效学指标用正交实验优选湿迪胶囊的提取工艺

王文静，贺 婧，姜婷婷，李励珺，黄罗生＊，富志军＊（中国药科大学中药学院 南京 211198）

目的 筛选湿迪胶囊处方的最佳提取工艺条件。方法 以小檗碱、黄芩苷、总氮含量和肿胀抑制率为评价指标，采用正交实验法优选出湿迪胶囊的最佳提取工艺。结果 以有效成分含量为指标确定提取方法为：6倍量水，提取2次，每次1h；以肿胀抑制率为指标确定提取方法为：9倍量水，提取2次，每次2h。而二者之间无相关性，最终以后者确定工艺条件为：加9倍量水，提取2次，每次2h。结论 结合药效学实验优选的提取工艺稳定可行，具有药物有效成分与功能主治密切结合的特点，为湿迪处方提取工艺提供依据。

湿迪胶囊；正交实验；棉球肉芽肿实验；高效液相色谱法；提取工艺

湿迪胶囊处方由黄柏、黄芩及蜈蚣组成，为临床名医的经验方，汤剂疗效显著，具有清热燥湿、息风止痉、攻毒散结、通络止痛的功效，用于治疗由于肝肾亏虚、阳气不足、腠理不密、卫外不固，以致风、寒、湿、邪乘虚而入，引起局部气血痹阻不畅所致的类风湿性关节炎［1］。本实验结合药效学实验［2］，以棉球肉芽肿炎症抑制率作为药效指标；根据胶囊中各药味作用、化学成分的性质，采用正交实验对湿迪胶囊的提取工艺进行筛选，探讨该复方中化学成分含量与药效学指标间的相关性，确保提取方法的可靠性，为该处方的剂型开发提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Shimadzu LC2010－HT高效液相色谱仪（日本岛津科技有限公司）；Sartrius A210P天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；AE240电子天平（瑞士梅特勒－托利多仪器有限公司）；R－202旋转蒸发器（上海申腾生物科技有限公司）；循环水式多用真空泵SHB－ⅢA（河南省太康科教器材厂）；KH－250DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；EPED－20TF实验室级纯水机（南京易普易达科技发展有限公司）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试药 黄柏、黄芩、蜈蚣均购于江苏省医药公司，经中国药科大学中药炮制教研室张春凤教授鉴定，均符合2010年版《中国药典》一部药材项下有关规定；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110713－201326）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110715－201318）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余均为分析纯。

1.3 动物 ICR小鼠，清洁级，体质量18～22g，由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计 传统中药常采用水煎煮法提取以保持复方的组成结构，发挥多成分的协同作用。在预实验及相关文献基础上［3］，选取加水量、煎煮次数和提取时间为考察因素。按处方比例称取全方共135g，水煎煮过滤，合并滤液，浓缩后加入无水乙醇，使醇的体积分数达到80%，静置24h，过滤，滤液回收乙醇，置于80℃水浴锅上浓缩至稠膏，减压干燥，粉碎得细粉以备用，测定黄芩苷、小檗碱及总氮含量；取水提醇沉溶液，浓缩至1g生药／mL，即得药效考察样品。

2.2 盐酸小檗碱和黄芩苷含量测定方法的建立［4－5］

2.2.1 色谱条件 Wondasil C18色谱柱（250mm× 4.6mm，5μm）；以乙腈－0.033mol·L－1KH2PO4（磷酸调pH3.0，25∶75）为流动相；流速为1.0mL·min－1；检测波长270nm；柱温30℃；进样量10μL。理论板数按黄芩苷和盐酸小檗碱计算均不低于7 000。色谱图见图1。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷对照品30.32mg和盐酸小檗碱对照品（在五氧化二磷干燥器中减压干燥12h）7.14mg，置于50mL量瓶中，加入甲醇适量使超声溶解30min，定容，摇匀，制成含黄芩苷0.606 4g·L－1和小檗碱0.142 8 g·L－1混合对照品溶液，作为储备溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取9份正交实验所得干浸膏粉末约0.03g，置于50mL量瓶中，加适量甲醇，超声30min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，按照上述色谱条件进样。

图1 HPLC图A.混合对照品；B.供试品；C.缺黄芩阴性对照；D.缺黄柏阴性对照；1.黄芩苷；2.小檗碱Fig.1 HPLC chromatagramsA.mixture standards；B.samples；C.Scutellaria nagative sample；D.Phellodendri nagative sample；1.baicalin；2.berberine

2.2.4 线性关系的考察 分别精密量取混合对照品溶液0.2，0.8，2，4，8和10mL，用甲醇定容于25mL量瓶中，摇匀，在上述色谱条件下进样，分别测定黄芩苷和盐酸小檗碱的峰面积，记录峰面积，以二者峰面积（Y）、对照品质量浓度（X）进行线性回归。线性方程：黄芩苷为Y1＝19 190 X1＋12 567，r＝0.999 9，在0.004 5～0.226 3g·L－1范围内线性关系良好；盐酸小檗碱为Y2＝28 375 X2＋1 787.3，r＝0.999 9，在0.001 1～0.057 1g·L－1范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液（黄芩苷93.01mg·L－1、盐酸小檗碱14.34mg·L－1）10μL，连续进样6次，计算黄芩苷、小檗碱峰面积的RSD分别为0.43%和0.38%，表明在此条件下仪器精密度良好。

2.2.6 重复性实验 取正交实验中1号样品，研细，精密量取粉末约0.05g，共6份，置于100mL量瓶中，按2.2.3项下方法制备，在上述色谱条件下，进样，记录色谱图。黄芩苷和小檗碱的峰面积RSD分别为1.37%和2.19%，结果表明，此方法有较好的重复性。

2.2.7 稳定性实验 取重复性实验项下1号样品，分别于放置0，3，6和9h后进行测定，进样10μL，共进样4次，测定其稳定性，黄芩苷和小檗碱的峰面积RSD分别为1.52%和1.77%，结果表明在9h内样品的稳定性良好。

2.2.8 加样回收率实验 取已知含量的浸膏粉样品0.03g，置于25mL量瓶中，精密加入0.038 8g·L－1黄芩苷对照品溶液1mL和0.005 67g·L－1盐酸小檗碱对照品溶液1mL，按2.2.3项下方法制备，平行6份，记录黄芩苷和小檗碱的峰面积，分别带入标准曲线计算黄芩苷和小檗碱的平均回收率分别为100.6%和98.68%，RSD分别为3.63%和3.36%。

2.3 总氮含量的测定 称取9组正交实验干燥的粉末提取物适量，采用凯氏定氮法测定不同提取条件下处方中总氮含量，该测定实验委托江苏省理化测试中心完成。

2.4 棉球肉芽肿形成实验［6］

2.4.1 无菌棉球的制备 用脱脂棉制成质量10± 0.5mg的小棉球，于121℃、0.1kPa下高温湿热灭菌20min。取出后于60℃下干燥24h，无菌储藏备用。

2.4.2 致炎方法 取雄性ICR小鼠，以10mL·kg－1的剂量腹腔注射40g·L－1水合氯醛进行麻醉。背部剪毛后进行常规碘酊消毒，酒精脱碘，切开皮肤，在双侧后肢根部位皮下各植入一粒无菌棉球，确定所植入棉球的形状与位置后缝合皮肤。随后肌肉注射青霉素钠（5万单位／只）防止感染。

2.4.3 分组与药物剂量 手术当天，动物全部苏醒后剔除死亡及状态虚弱的个体，将剩余动物按体质量随机分为10组：模型组（给予蒸馏水）、样品组（给药剂量均为4.50g·kg－1），每组9只。以20mL·kg－1等容积灌胃给药，每日1次，连续7d。

2.4.4 测定方法 于第8日将小鼠脊椎脱臼法处死，剥取分离棉球及其周围肉芽组织，并于60℃下烘干24h至恒质量并精密称质量。

2.4.5 计算公式［7］

肉芽组织质量（mg）＝棉球干质量－棉球质量炎症抑制率（%）＝［（对照组肉芽组织平均质量－给药组肉芽组织平均质量）／对照组肉芽组织平均质量］×100%

2.5 结果分析 本实验选用L9（34）正交表，以黄芩苷、小檗碱、总氮含量及炎症抑制率为考察指标，化学指标评分公式＝ （小檗碱含量／最高组小檗碱含量× 0.4＋黄芩苷含量／最高组黄芩苷含量×0.3＋总氮含量／最高组总氮含量×0.3）×100。实验安排及结果见表1，抗炎抑制率方差分析见表2。

表1 湿迪胶囊提取工艺正交实验结果Tab.1 Result of orthogonal test of extraction process of Shidi Capusles

表2 肿胀抑制率方差分析结果Tab.2 Variance analysis of the swelling inhibition rate

本实验将药效实验中的炎症抑制率与黄芩苷含量、小檗碱含量、总氮含量相结合，正交实验中评价指标较多，结合化学指标综合加权法和药效学肿胀抑制率进行评价，结果有效成分含量与炎症抑制率间无明显相关性，为获得较好的临床疗效，最终以药效学为评价指标确定最佳的提取工艺条件。

以炎症抑制率为评价指标，方差分析结果表明，影响因素的主次顺序为A＞B＞C，其中A对抑制率影响最大，并具有显著性意义。因此确定提取条件为A2B2C2，即以9倍量水提取2次，每次2h。

2.6 工艺验证实验 按处方比例称取各药材3份，以最佳工艺条件进行提取，按2.4项下方法测定，计算炎症抑制率分别为41.0%，43.4%和42.3%，RSD为1.31%，表明优选的工艺稳定可行。

3 讨论

目前在对中药复方提取工艺的研究中，大多数采用单一有效成分或有效部位含量作为指标进行工艺筛选，但这些化学成分含量的高低往往难以代表整个复方的药效。湿迪处方中所含生物碱类小檗碱具有抗炎及免疫抑制等功效，在历代治疗类风湿关节炎复方中广泛应用，而黄酮类成分黄芩苷和氨基酸类成分分别在抗菌、镇痛方面较为常用，权衡三者在该复方中的作用，本研究以有效成分小檗碱、黄芩苷含量及总氮含量的综合评分为指标，权重系数分别为0.4，0.3和0.3，并结合药效学实验进行筛选，使提取工艺更趋科学、合理。但由于有效成分含量结果和药效结果之间无相关性，最终以抗炎药效作用为考察指标，达到尽可能保证中药复方提取物疗效的目的。

中药是一个有效成分群组合，并以多靶点、多途径作用于人体，其药效是有效成分群之间组合协同作用的结果［8］。因此，为保证有效成分的提取率和中药复方的整体药效，提取工艺应从药效出发筛选工艺，不仅能克服传统中药提取从理化性质出发的不足，而且还能认识到药效评价才是确保中药提取工艺先进和有效的依据。中药复方的某些化学成分能否代表整个复方的药效值得深入研究，药效学指标和化学指标之间是否存在某些相关性仍需进一步探讨。

［1］柳春，陈丽，梁永林.中药复方治疗类风湿性关节炎的规律及其Logistic回归模型［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（21）：1－5

［2］黎迎，杜守颖，陆洋，等.正交实验结合药效学实验优选复方南星止痛膏处方提取工艺［J］.中国中药杂志，2013，38（16）：2590－2593.

［3］牛阳，张霞，王荣，等.八珍益智颗粒提取工艺研究［J］.西北药学杂志，2012，27（4）：294－296.

［4］张婷婷，赵军，杨蒙蒙，等.HPLC法同时测定中药复方乳膏中盐酸小檗碱和阿魏酸的含量［J］.西北药学杂志，2014，29（3）：245－247.

［5］金良，李亚男，张秋燕，等.连梅饮中黄芩苷和小檗碱的含量测定［J］.中国现代医药杂志，2009，11（12）：32－34.

［6］苏鑫，宫晓燕.新扶正除疫颗粒对小鼠耳廓肿胀及大鼠肉芽肿的实验研究［J］.时珍国医国药，2014，25（10）：2334－2335.

［7］张丽，薛国娜，朱镭，等.消痤胶囊治疗痤疮抗炎作用的实验研究［J］.中医药导报，2014，20（11）：10－12

［8］张铁军.中药质量认识与质量评价［J］.中草药，2011，42（1）：1－9.

Optimization of the extraction process of Shidi Capsules by orthogonal test with pharmacodynamics index

WANG Wenjing，HE Jing，JIANG Tingting，LI Lijun，HUANG Luosheng＊，FU Zhijun＊（Traditional Chinese Medicine College，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Objective To optimize the extraction process of Shidi Capsules.Method The extraction process conditions of Shidi Capsules were optimized by an orthogonal test and pharmacodynamics test.The contents of berberine，baicalin，and the total nitrogen，and the anti－inflammatory results were used as the evaluated indexes.Result The optimal extracting conditions were as follows：extracted two times with 6fold amount of water，1heach time.If using swelling inhibitory rate as the evaluating index，extracted two times with 9fold amount of water，2heach time.There was no relationship between the two methods.Conclusion Combined the orthogonal test and pharmacodynamic test to optimize the extraction process has the advantages of stable and practical，which was suitable for the extraction of Shidi Capsules.

Shidi Capsules；orthogonal test；tampon granuloma test；HPLC；extraction process

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.003

R284

A

1004－2407（2015）04－0337－04

2015－03－18）

国家科技重大专项（编号：2013ZX09301303001007）

王文静，女，在读硕士研究生

＊通信作者：黄罗生，男，副研究员；富志军，男，副教授