正交试验优选裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的水提取工艺

王 勇， 文 菀， 李永辉

（海南医学院药学院，海南海口571199）

正交试验优选裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的水提取工艺

王 勇， 文 菀， 李永辉

（海南医学院药学院，海南海口571199）

目的优选裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的水提取工艺。方法以浸膏得率和毛蕊花糖苷及异毛蕊花糖苷的提取得率为评价指标，考察浸泡时间、加水倍量、提取时间、提取次数等因素，采用正交试验法优选最佳水提取工艺。结果裸花紫珠叶水提取最佳工艺为药材加水浸泡2 h、提取3次、加水倍量分别为20、15、15，每次提取1 h。结论优选出的水提取工艺简单可行，可用于裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的提取。

裸花紫珠；苯乙醇苷；正交试验；提取工艺

裸花紫珠为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook Et Arn.的干燥叶及嫩枝，为海南大宗道地药材之一，也是海南黎族医生常用的止血药材之一。裸花紫珠性凉、味苦涩，具有抗菌、止血、凉血、清热解毒、散瘀消肿之功效，主治各种炎症、外伤出血、跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症［1］。紫珠属植物的化学成分研究表明，苯乙醇苷类成分是该属植物的主要类群成分之一［2］。裸花紫珠具有较强的止血作用，其中的苯乙醇苷类化合物——毛蕊花糖苷（acteoside，AS）和异毛蕊花糖苷（isoacteoside，IAS）有显著缩短活化部分凝血活酶时间 （APTT）作用，提示裸花紫珠可能是通过影响内源性凝血途径来发挥止血作用，其中毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在药材中的含有量很高，可能是裸花紫珠止血的主要活性成分［3］。本研究采用正交设计，以浸膏得率，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取得率为指标，综合评价，筛选裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的水提取工艺，为裸花紫珠叶及其制剂的进一步研究开发利用提供依据。

1 仪器与材料

6CH-18茶叶烘焙箱 （福建安溪兴民机械有限公司）；AL-104电子天平 （梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司）；XS105 Dua1Range分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；98-1-B电子调温电热套 （天津市泰斯特仪器有限公司）；九阳电磁炉 （九阳股份有限公司）；202AB-1电热干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司），Shimadzu LC-2010AHT高效液相色谱仪 （配有紫外检测器，自动进样器，LC so1ution色谱工作站）。甲醇、醋酸、无水乙醇均为分析纯，购自广州化学试剂厂，乙腈为色谱纯，水为超纯水。毛蕊花糖苷 （批号120804）与异毛蕊花糖苷对照品（批号130512）购自四川维克奇生物科技有限公司。裸花紫珠药材于2013年8月采自海南省白沙县，经作者鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠C.nudiflora Hook Et Arn.的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 药材水分测定 取裸花紫珠叶粗粉3份，每份约2 g，精密称定 （2.061 2、2.047 5、2.049 4 g），按 《中国药典》2010年版附录Ⅸ水分测定法第一法烘干法测定［4］，水分分别为9.61%、10.22%、9.77%，平均水分为9.87%。

2.2 浸膏得率的测定 精密量取裸花紫珠提取后浓缩液25 mL置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，并于105℃加热干燥3 h，迅速转移至干燥器中冷却0.5 h，称定质量，计算浸膏得率 （扣除药材水分，以干燥药材计）。

2.3 毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的测定

2.3.1 色谱条件［5-8］Luna C18（2）色谱柱 （150 mm× 4.6 mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液（15∶85）；体积流量1.0mL/min，检测波长332 nm；柱温30℃。

2.3.2 线性关系考察 精密称取毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对照品，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成每1mL含毛蕊花糖苷0.103 2mg、异毛蕊花糖苷0.103 6 mg的混合对照品溶液。取适量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进样，进样体积分别为2、4、8、10、12、16、20μL，测定毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的峰面积，分别以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的进样量 （μg）为横坐标 （X）、峰面积为纵坐标 （Y），绘制标准曲线，得到毛蕊花糖苷的回归方程为Y=1 788 946.61X-42 034.33，r=1.000 0，线性范围为0.206 4～2.064μg；异毛蕊花糖苷的回归方程为Y=1 724 575.34X-49 469.72，r= 1.000 0，线性范围为0.207 2～2.072μg。

2.3.3 样品测定 取裸花紫珠提取后浓缩液0.5 mL，置25mL量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度。取适量，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，测定，记录色谱图，计算毛蕊花糖苷 （AS）和异毛蕊花糖苷 （IAS）量及提取得率（扣除药材水分，以干燥药材计）。

对照品和供试品溶液色谱图如图1所示。

图1 对照品（A）和供试品（B）溶液的HPLC色谱图

2.4 药材浸泡时间考察 取剪碎后的裸花紫珠叶4份，每份20 g，分别加入20倍量蒸馏水浸泡0.5、2、4、12 h，加热回流提取2次，第1次2 h，第2次加入15倍量蒸馏水回流提取1 h，200目滤布滤过，合并两次滤液，加热浓缩，浓缩液冷却后，加蒸馏水定容至100 mL。按 “2.2”项和“2.3.3”项分别测定浸膏得率、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取得率。结果见表1。浸泡时间对于浸膏得率影响不大，但浸泡时间为2 h时AS+IAS得率最高，从而选择浸泡时间为2 h。

表1 药材浸泡时间考察结果

2.5 药材水提取工艺因素与水平 裸花紫珠叶中主要苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷易溶于水，因此采用水加热回流提取方法，考察加水量，回流时间和提取次数3个因素，每个因素考察3个水平，因素水平见表2。

表2 正交试验的因素与水平

2.6 提取工艺正交试验方法与结果 取剪碎后的裸花紫珠叶9份，每份20 g，依次编号为1～9试验组。药材均先浸泡2 h后，按照表3中L9（34）正交表规定的条件进行回流提取，提取液均用200目纱布滤过，合并滤液，加热浓缩，浓缩液冷却后，加蒸馏水定容至100 mL，摇匀。按 “2.2”项方法测定浸膏得率，按 “2.3.3”项方法测定毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含有量，测定结果见表3。以综合评分值为指标，对结果进行方差分析，列出方差分析表，见表4。

比较各因素的极差可知，因素C（提取次数）对试验结果影响最大，其次是A和B，所以因素对综合评分值指标影响大小排序为C＞A＞B。由方差分析可知，因素C具有显著性差异。根据极差分析各因素的均值，可确定裸花紫珠药材水提取最佳工艺为A3B2C3，即药材浸泡时间2 h后，提取3次，加水量分别为20，15，15倍量，每次提取时间为1 h。

表3 提取工艺正交试验设计与结果

表4 方差分析结果

2.7 工艺验证性试验 称取裸花紫珠药材3份，每份50 g，按上述确定的最佳工艺条件提取，对药材水提取工艺进行验证，测定结果见表5。结果表明，由上述确定的最佳方案提取苯乙醇苷类化合物提取率较高，该方案较稳定。

表5 药材水提取工艺验证性实验结果

3 讨论

在考察色谱条件时，参考文献 ［5-8］考察了乙腈-0.1%醋酸 （20∶80、18∶82、17∶83、16∶84）不同比例的流动相，结果供试品溶液中毛蕊花糖苷色谱峰与相邻色谱峰的分离度均不理想，最后选用乙腈-0.1%醋酸（15∶85），毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷分离度均较好。

选取测定指标时，曾参考文献 ［9-10］选取了3种苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、异毛蕊花糖苷和1种黄酮苷类化合物木犀草苷，结果毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在裸花紫珠水提取液中含有量比较高，而连翘酯苷B和木犀草苷含有量相对较低，且与相邻色谱峰未达基线分离，未选用这两个成分为指标，因此最终选择以毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷作为测定指标。

在处理数据时，引进综合评价的理念，将2个评价指标转化成一个数值，这种多指标综合加权评分法可以避免单一评价的片面性，使分析结果更加科学、客观，使得提取工艺趋于合理、可信［11］。本研究以浸膏得率、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取得率为指标，采用单因素试验确定了裸花紫珠叶的浸泡时间，采用正交试验设计，结合综合评分法［12-14］，对裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的水提取工艺进行研究，确定了最佳的提取工艺：药材加水浸泡2 h，提取3次，加水倍量分别为20、15、15，每次提取1 h。由于裸花紫珠叶的吸水率较大 （4.8 mL/g），故在选择加水量的水平时第1次加入量比后两次大。本研究确定的提取工艺简单可行，3次验证试验结果重复性较好，可为裸花紫珠叶中苯乙醇苷类成分的提取提供参考。

裸花紫珠叶水提取所得浸膏得率较高，达35%以上，提取物 （液）杂质较多，需采用离心、醇沉、絮凝或大孔树脂分离纯化等方法进一步除杂。两种苯乙醇苷类成分含有量较文献 ［9］报道的高，可能与药材采收季节、产地、提取方法、提取溶剂和提取时间等因素有关。另外异毛蕊花糖苷在提取物 （液）中的相对含有量随着提取时间的延长会增加。这两种异构体在加热提取过程中是否会发生相互转化，还需进一步研究。

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R284.2

B

1001-1528（2015）08-1856-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.052

2014-05-12

海南省自然科学基金 （813192）

王 勇 （1982—），男，硕士，副研究员，从事南药与黎药化学成分、提取工艺与质量控制研究。Te1：（0898）66895337，E-mai1：wangyong1982-2004@a1iyun.com