华蟾素抑制人胃癌BGC-823细胞体外侵袭、迁移的机理
2015-01-18乔翠霞张新峰蔡小平程旭锋
乔翠霞， 张新峰， 蔡小平*， 程旭锋
（1.河南省中医药研究院附属医院肿瘤科，河南郑州450004；2.河南省肿瘤医院中西医科，河南郑州450000；3.河南中医学院第一附属医院乳腺科，河南郑州450000）
华蟾素抑制人胃癌BGC-823细胞体外侵袭、迁移的机理
乔翠霞1， 张新峰2， 蔡小平1*， 程旭锋3
（1.河南省中医药研究院附属医院肿瘤科，河南郑州450004；2.河南省肿瘤医院中西医科，河南郑州450000；3.河南中医学院第一附属医院乳腺科，河南郑州450000）
目的探讨华蟾素（Cinobufacin）体外抑制人胃癌BGC-823细胞侵袭的作用及其机制。方法以0.156 mg/L和0.313 mg/L华蟾素体外作用人胃癌BGC-823细胞，采用MTT法检测华蟾素对BCG-823细胞生长的抑制效果，Transwe11小室法检测细胞的迁移和侵袭能力，Western b1ot法检测BGC-823细胞中NF-κB p56、MMP-9蛋白的表达量。结果华蟾素可浓度依赖性抑制体外BGC-823细胞增殖、迁移和侵袭，同时下调BGC-823细胞中NF-κB和MMP-9蛋白表达。结论华蟾素体外可抑制胃癌的转移，该作用可能通过下调NF-κB、MMP-9的表达相关。
人胃癌BGC-823细胞；华蟾素；NF-κB；MMP-9；侵袭；迁移
华蟾素注射液（Cinobutacini injection，CINO）是采用中华大蟾蜍的外皮提取的中成药制剂，有化瘀、解毒散结等作用，为国家级中药保护品种。华蟾素具有多种抗肿瘤活性，可用于原发性肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、白血病、胰腺癌、皮肤癌等多种晚期恶性肿瘤的防治，相关临床及基础研究结果已见报道［1-3］。但这些研究主要集中在华蟾素抑制肿瘤细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和改善患者生存质量、延长生存时间等方面，而在抑制肿瘤转移方面的研究尚未见文献报道。本研究旨在探究华蟾素对人胃癌细胞转移的影响及其机理研究，从而为本课题进一步深入研究华蟾素注射液抑制肿瘤的复发转移奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药品和主要试剂 华蟾素注射液购自湖北诺得胜制药有限公司。Matrige1基底膜基质胶由Becton，Dickinson and Company（美国）提供；DMEM培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺均为美国Invitrogn公司产品；牛血清白蛋白、二甲基亚砜 （DMSO）均为生物工程 （上海）有限公司产品；噻唑蓝（MTT）由Sigma公司（美国）提供；核因子κB p65（NF-κB p65）抗体、基质金属蛋白酶9（Matrixmeta11oproteinases 9，MMP-9）抗体和β肌动蛋白（β-actin）抗体均为美国Epitomics公司产品；实验所用的所有Transwe11小室均由CORNINGCompany（美国康宁公司）提供；RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；上海碧云天公司提供结晶紫染色试剂盒。
1.2 细胞培养 人胃癌BGC-823细胞（美国模式菌种收集中心ATCC）。将细胞接种于培养瓶，培养液为DMEM培养基（葡萄糖4.5 g/L），其中含10%胎牛血清，置于5%CO2、37℃培养箱中，细胞按5×104个/cm2接种于24孔培养板。
1.3 MTT法 BGC-823细胞在37℃、5%CO2的培养箱中用DMEM培养液培养。取对数生长期BGC-823细胞，制备密度为1×105个/mL的细胞悬液；取96孔板，每孔加入200μL细胞悬液［11］，常规培养24 h后，加入用不含血清的DMEM培养基稀释的受试华蟾素溶液，其中华蟾素终质量浓度分别为 0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5 mg/L，均分别培养24、48、72 h，各质量浓度、时间点均设3个复孔 （n=3）。培养结束后，每孔中加入2 mg/mLMTT溶液50μL，然后将以上溶液再培养4 h；接着放弃各个培养孔内液体，均加入150μL DMSO溶剂，持续进行振荡共10 min，最后将酶标仪设置在570 nm波长处测定吸光度（OD）值，计算细胞存活率，每组实验均重复3次。
注：细胞存活率 =［（OD实验组-OD背景组）/（OD对照组-OD背景组）］×100%。
1.4 细胞侵袭实验 将50μL人工基质胶分别涂敷于Transwe11插入式的培养皿滤膜的24孔表面，然后将其放在37℃的培养箱中孵育6 h，最后形成凝胶状物质。取对数生长期的、用无血清DMEM处理24 h的BGC-823细胞，分别加不同浓度的、无血清DMEM稀释的华蟾素（0.156和0.313 mg/L），并设不含华蟾素的无血清DMEM作为对照，预处理细胞2 h，消化、离心。然后将细胞悬液制备成密度达到5×105个/mL，用移液器取出200μL含华蟾素或不含华蟾素处理过的细胞悬液，分别将其加到插入式Transwe11培养皿的24孔上室，然后在24孔Transwe11培养皿板的各个下室均添加600μL含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，下层培养液和Transwe11培养皿间避免存在气泡，以上各个实验组均设置5个复孔。将其培养24 h之后，取出滤膜，将以上各小室内表面没有穿透滤膜的细胞均擦掉，用甲醇溶液进行15 min的固定，随后用 PBS缓冲液漂洗3次，接着用0.1%结晶紫在室温下进行30 min染色，再次用PBS缓冲液漂洗3次，最后将其在倒置显微镜下对膜背面的细胞数 （N）进行计数，采用随机计数共10个视野，计算出其中的平均数值。以上每一组均要反复进行3次，侵袭抑制率=（1-N实验组/ N对照组）×100%。
1.5 BGC-823细胞的体外迁移实验 本研究中BGC-823细胞的迁移实验方法与侵袭实验流程相同，区别在于迁移实验的24孔Transwe11培养皿滤膜的内部表层上没有使用Matrige1基底膜基质［4］。
1.6 Western b1ot法 将对数生长期的BGC-823细胞按5×105个/孔的密度加入6孔板中，待细胞覆盖皿底80%～90%去除旧培液，加入不含或含不同质量浓度（0.156和0.313 mg/L）华蟾素的细胞培液作用48 h后，RIPA裂解细胞10 min，18 000×g离心15 min（4℃），提取上清液，样品用Bio-Rad protein assay进行总蛋白含量的测定。然后取等量蛋白质的样品 （30μg/孔），接着采用8% SDS-PAGE进行电泳分析实验，使用半干转膜仪进行转膜，用5%脱脂奶粉将其封闭后，分别滴加相应的兔抗人抗体使之成为第一抗体，用HRP标记过的羊抗兔IgG标成第二抗体，随后进行ECL显色，最后将X线各个胶片均曝光。各显色条带吸光度值测定使用Quantity One（BIO-RAD公司）软件分析，第一步测定各个蛋白印迹密度与内参β-actin印迹比值，接着将各个华蟾素处理过的组分别与同对照组对比，最终测得蛋白的相对表达量。
2 统计方法
3 结果
3.1 华蟾素对BGC-823细胞增殖的影响 如图1所示，华蟾素对BGC-823细胞存活率的抑制作用呈时间和质量浓度依赖性。较低质量浓度的华蟾素（0.156和0.313 mg/L）作用BGC-823细胞24、48、72 h，细胞存活率无明显下降；较高质量浓度的华蟾素（2.5、5 mg/L）作用BGC-823细胞48 h后，细胞存活率明显下降，其细胞生长抑制率分别为69.25%和86.01%，而当5 mg/L的华蟾素作用BGC-823细胞24 h后，抑制率即达到78.35%。该结果提示，高质量浓度的华蟾素对BGC-823细胞增殖具有明显的抑制作用，但也有因BGC-823细胞活力受到抑制的因素影响。本研究进一步选用质量浓度为0.156 mg/L和0.313 mg/L华蟾素，分别作用于BGC-823细胞24 h。
图1 华蟾素对BGC-823细胞增殖的抑制作用Fig.1 G row th inhibitory effects of Cinobufacin on BGC-823 cells
3.2 华蟾素对BGC-823细胞体外侵袭能力的影响
华蟾素可显著抑制体外BGC-823细胞侵袭能力，且呈质量浓度依赖性 （表1）。与对照组比较，华蟾素（0.156 mg/L和0.313 mg/L）组侵袭细胞数均显著减少（P＜0.01）；与华蟾素（0.156 mg/L）组比较，华蟾素（0.313 mg/L）组侵袭细胞数显著减少 （P＜0.05）。
表1 华蟾素对BGC-823细胞侵袭能力的影响（，n=5）Tab.1 Effect of Cinobufacin on the invasion ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）
表1 华蟾素对BGC-823细胞侵袭能力的影响（，n=5）Tab.1 Effect of Cinobufacin on the invasion ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）
注：与对照组比较，**P＜0.01；与华蟾素 （0.156 mg/L）组比较，△P＜0.05
组别 质量浓度/（mg·L-1）细胞数/（个/视野） 抑制率/%对照组 — 168.92±19.47—49.02华蟾素组 0.156 113.96±14.64** 32.36华蟾素组 0.313 85.92±11.13**△
3.3 华蟾素对BGC-823细胞体外迁移能力的影响
华蟾素能显著抑制BGC-823细胞体外迁移，并呈质量浓度依赖性 （表2）。与对照组比较，华蟾素（0.156 mg/L和0.313 mg/L）组迁移细胞数均显著减少 （P＜0.01）；与华蟾素（0.156 mg/L）组比较，华蟾素 （0.313 mg/L）组迁移细胞数显著减少（P＜0.05）。
表2 华蟾素对BGC-823细胞迁移能力的影响 （，n=5）Tab.2 Effect of Cinobufacin on the m igratory ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）
表2 华蟾素对BGC-823细胞迁移能力的影响 （，n=5）Tab.2 Effect of Cinobufacin on the m igratory ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）
注：与对照组比较，**P＜0.01；与华蟾素 （0.156 mg/L）组比较，△P＜0.05
组别 质量浓度/（mg·L-1）细胞数/（个/视野） 抑制率/%对照组 — 383.28±33.84—45.64华蟾素组 0.156 254.56±27.90** 33.58华蟾素组 0.313 208.36±19.56**△
3.4 华蟾素对BGC-823细胞中NF-κB p65和MMP-9表达的影响 根据Western b1ot检测结果，作用BGC-823细胞24 h后，与对照组比较，华蟾素（0.156 mg/L和0.313 mg/L）可明显下调BGC-823细胞中NF-κB p65、MMP-9蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）；与华蟾素 （0.156 mg/L）比较，华蟾素（0.313 mg/L）组NF-κB p65、MMP-9蛋白表达显著降低 （P＜0.05），见表3。
表3 华蟾素对NF-κB p65和MM P-9表达的影响（n=3）Tab.3 E ffect of Cinobufacin on the expressions of NF-κB p65 and MMP-9 in BGC-823 cells（n=3）
4 讨论
多项研究表明，华蟾素具有抑制胃癌细胞增殖、促进其凋亡作用［5-9］；本研究体外实验也发现，华蟾素提取物可抑制胃癌BGC-823细胞的增殖，并且华蟾素的抑制效果具有浓度依赖性和时间依赖性。但华蟾素对胃癌转移的影响尚未见报道；为此，在本研究中采用Transwe11小室进行细胞迁移、侵袭实验，观察胃癌对结胃癌细胞侵袭转移的影响，并探讨其作用机理。
肿瘤侵袭转移过程非常复杂，其关键是穿透生物学屏障［10］。目前研究发现细胞外基质 （Extrace11u1armatrixc，ECM）是恶性肿瘤侵袭转移的重要屏障，而基质金属蛋白酶家族 （MMPs）是通过阻断ECM降解而切断转移通路的［11-12］；MMP-9是通过降解ECM中明胶和Ⅳ型基底膜胶原抑制肿瘤侵袭转移的［13］。本实验中，华蟾素可明显抑制BGC-823细胞的侵袭和转移，并可明显下调MMP-9蛋白在人胃癌BGC-823细胞中表达；表明华蟾素可能是通过抑制MMP-9在胃癌中的表达从而抑制胃癌细胞的侵袭转移。
核因子-κB（NF-κB）通过调控MMP-9基因［14］，从而影响MMP-9蛋白的表达，达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移［15］。P50和ReIA（P65）二异聚体是NF-κB的两种主要存在形式，因此实验中往往以P65来反映NF-κB的表达情况。研究表明［16］，百里醌等能通过抑制肿瘤细胞中NF-κB的表达从而有效抑制肿瘤的侵袭转移。本实验也发现华蟾素可抑制NF-κB p65在人胃癌BGC-823细胞中的表达，同时抑制BGC-823细胞的迁移和侵袭。
综上所述，本研究发现华蟾素不但具有抑制人胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用，而且能抑制BGC-823细胞中NF-κB、调控MMP-9的表达。由此本课题将进一步研究华蟾素是否可能通过抑制NF-κB及其调控蛋白MMP-9的表达的机理，而达到抑制BGC-823细胞侵袭转移的。
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Inhibitory effect of Cinobufacin on the invasion and m igration of hum an gastric carcinom a BCG-823 cells and itsmechanism in vitro
QIAO Cui-xia1， ZHANG Xin-feng2， CAIXiao-pin1*， CHENG Xu-feng3
（1.Tumor Department，Henan Academy of Traditional ChineseMedicine，Zhengzhou 450008，China；2.Integrated TCM&Western Medicine Department，Henan Provincial Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China；3.The First Hospital Affiliated to Henan TCM University，Zhengzhou 450008，China）
AIMTo investigate the anti-invasive effect of Cinobufacin on the human gastric carcinoma BCG-823 ce11s and its mechanism in vitro.M ETHODSBCG-823 ce11s were treated by 0.156 mg/L and 0.313 mg/LCinobufacin.Their inhibitory action wasmeasured by MTTassay.Themigration and invasive abi1ity of BCG-823 ce11sweremeasured by Transwe11assay.Western b1otana1ysiswas performed on NF-κB p56，MMP-9 in BCG-823 ce11s.RESULTSCinobufacin significant1y inhibited the growth，migration and invasive abi1ity of BCG-823 ce11s in a dose-dependentmanner.The expressions of NF-κB and MMP-9 were suppressed and the MMP-9/TIMP-1 ratio reduced after the treatment with Cinobufacin.CONCLUSIONSCinobufacin can inhibit themigration and invasion of BCG-823 ce11s probab1y by down-regu1ating the expression of NF-κB and MMP-9.
human gastric carcinoma BCG-823 ce11s；Cinobufacin；NF-κB；MMP-9；invasion；migration
R966
A
1001-1528（2015）08-1655-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.005
2014-10-12
河南省中医药管理局课题 （2013ZY02026）
乔翠霞 （1982—），女，博士，主治医师，主要从事中西医结合防治肿瘤的研究。Te1：13937160118，E-mai1：zhangxinfeng125@126.com
*通信作者：蔡小平（1964—），男，主任医师，硕士生导师，主要从事中医药防治恶性肿瘤的研究。E-mai1：qiaocuixia@126.com
