安神定志灵对SHR大鼠前额叶皮质去甲肾上腺素alpha 2A受体蛋白表达的影响

雷 爽， 韩新民，*， 袁海霞， 孙继超

（1.南京中医药大学附属医院，江苏南京210029；2.南京中医药大学，江苏南京210023）

安神定志灵对SHR大鼠前额叶皮质去甲肾上腺素alpha 2A受体蛋白表达的影响

雷 爽1， 韩新民1，2*， 袁海霞2， 孙继超2

（1.南京中医药大学附属医院，江苏南京210029；2.南京中医药大学，江苏南京210023）

目的研究安神定志灵对注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）动物模型-自发性高血压大鼠（spontaneous1y hypertensive rat，SHR）前额叶皮质去甲肾上腺素a1pha2A受体（a1pha2A adrenergic receptor，ADRα2A）蛋白表达的影响，探讨该药治疗ADHD的作用机制。方法40只自发性高血压大鼠随机分为5组（模型组，托莫西汀组，安神定志灵低、中、高剂量组），每组8只，Wistar京都大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）8只作为正常对照组。安神定志灵低、中、高剂量组分别按生药剂量11.85、23.7、47.4 g/（kg·d）灌胃，每日1次；托莫西汀组以5 mg/（kg·d）给予托莫西汀灌胃，每日1次；模型组和正常对照组每日按体质量给予等量生理盐水灌胃。实验4周后处死大鼠，采用免疫组化和Western b1ot法检测各组大鼠前额叶皮质脑组织ADRα2A蛋白表达水平。结果模型组和正常对照组比较，ADRα2A蛋白表达水平显著降低 （P＜0.05）；托莫西汀组、安神定志灵各剂量组ADRα2A的表达水平均高于模型组，差异有统计学意义 （P＜0.05），且以安神定志灵中剂量组的ADRα2A蛋白表达最为显著，与托莫西汀组相比，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结论托莫西汀及安神定志灵可以显著上调SHR大鼠前额叶皮质中ADRα2A蛋白的表达水平，说明前额叶皮质去甲肾上腺素a1pha2A受体可能是安神定志灵的作用靶点之一。

安神定志灵；注意缺陷多动障碍；自发性高血压大鼠；去甲肾上腺素a1pha2A受体

注意力缺陷多动障碍 （ADHD）是儿童期常见的精神行为障碍性疾病，全球学龄期儿童及青少年患病率约为5.29%［1］，对个人、家庭和社会产生深远的负面影响。ADHD的病因及发病机制复杂，遗传、环境、解剖及神经递质等是目前研究的热点。在临床辨证中，韩新民教授提出该病实证病机多属 “心肝火旺、痰火内扰”，主以 “清心平肝，豁痰开窍，安神定志”为治则。安神定志灵是韩新民教授结合多年的临床实践，以上述治则为指导而形成的验方，前期临床研究显示疗效确切［2］。对其实验作用机制也进行了积极探索，主要集中在多巴胺系统水平上［3-4］。本实验从去甲肾上腺素角度，选用被认为最具有特征性及目前最合适的自发性高血压大鼠动物模型［5］研究安神定志灵对去甲肾上腺素a1pha2A受体蛋白表达的影响，以期进一步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 SHR大鼠40只，WKY大鼠8只，均为4周龄，雄性，体质量65～90 g，清洁级 （北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证 SCXK［京］2012-0001）。饲养于南京中医药大学动物实验中心，自由饮食进水，正式试验之前适应性饲养5 d。

1.2 药物 安神定志灵由醋柴胡、黄芩、石菖蒲、益智仁、郁金、炙远志等药物组成 （江苏省中医院中药房），按低、中、高剂量制成水煎剂，生药质量浓度分别为0.592 5、1.185、2.37 g/mL，4℃冰箱保存备用；西药托莫西汀 （产品批号C165365，英国礼来），用生理盐水配制成终质量浓度0.5 mg/mL，现配现用；生理盐水 （批号2012042409，南京小营药业）。

1.3 主要仪器 电泳槽、Trans-B1ot SD蛋白半干转印仪（美国Bio Rad公司）；面包式离心机、高速台式冷冻离心机、移液枪 （德国Eppendorf公司）；漩涡振荡器、转移及水平摇床 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；精密天平、pH/酸度仪 （德国Sartorius公司）；制冰机 （美国Scotsman公司）；酶标仪（美国Peking E1mer公司）；Image Quant LAS 4000mini超灵敏化学发光成像仪（美国GE公司）；石蜡包埋机、全自动组织脱水机、轮转式切片机（德国Leica公司）。

1.4 主要试剂 4%多聚甲醛PBS缓冲液，10%水合氯醛；Envision免疫组化检测试剂盒 （福建迈新生物技术有限公司）；﹟4970Sβ-actin多克隆抗体 （美国CST）；ab65833 ADRα2A抗体、羊抗兔二抗（美国Abcam）；RIPA裂解液（强）、PMSF、10%十二烷基磺酸钠 （碧云天生物技术有限公司）；Trish-base、甘氨酸（北京索莱宝）；光明牌脱脂奶粉 （光明乳业）；2×上样缓冲液、29∶1丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺混合物、过硫酸铵、PVDF膜（美国Bio Rad）；11-180kDa预染蛋白Marker（中国台湾Genedirex）；ECL化学发光底物（美国Thermo）。

2 实验方法

2.1 动物分组及处理 40只自发性高血压大鼠随机分为5组：模型组，托莫西汀组，安神定志灵低剂量组、中剂量组、高剂量组。8只WKY大鼠被设为正常对照组。托莫西汀组给予临床等效剂量5 mg/（kg·d），安神定志灵中剂量为临床等效剂量23.7 g/（kg·d），低剂量组给药11.85 g/（kg·d），高剂量组给药47.4 g/（kg·d）。各组大鼠每日给予灌胃1次，正常组和模型对照组给予同等剂量的生理盐水灌胃，持续4周。

2.2 标本制备 各实验组均在最后1次灌胃后2 h处死，各组1～8号随机抽出3只动物用10%水合氯醛麻醉处理，充分暴露心脏后，将灌注针头插入左心室心尖，剪开右心耳，用生理盐水快速灌注，待肝脏颜色变淡后换4%多聚甲醛的PBS缓冲液缓慢灌注；迅速剥离脑组织，放入固定皿中0.5 cm、1 cm处冠状切为前、中、后三段，4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋及冠状切片 （厚度4～6μm）。

各组剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉后断头取脑，放入冰冷生理盐水中冲洗干净，冰台上迅速分离出大脑两侧的前额叶皮质，放入相应编号的冻存管中，-70℃保存备用。

2.3 免疫组织化学法 取常规前额叶石蜡切片，每组各10张，主要步骤如下：常规脱蜡至水，灭活内源性过氧化物酶，先后加入复合消化液消化、抗原修复液修复、正常山羊血清封闭液封闭，然后滴加ADRα2A一抗，37℃孵育2 h，滴加生物素化二抗，37℃孵育1 h，滴加SABC于37℃放置30 min，采用DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。200倍显微镜下观察结果，以淡黄色或棕黄色颗粒染色为阳性表达。每张切片随机选取5个视野，采用Image-Pro P1us 6.0图像分析软件，以平均光密度值（mean density）表示各组ADRα2A蛋白的相对表达量。

2.4 Western b1ot法 按每20 mg前额叶皮质脑组织加入150～250μL RIAP裂解液与PMSF混合液（比例为100∶1），球磨仪研磨，冰上裂解30min后，4℃下15 000 r/min离心30min，取上清，即为所取组织总蛋白。采用BCA法测定相应蛋白定量并调平，2×上样缓冲液混匀后行蛋白变性，-70℃冰箱储存备用。分别用5%浓缩胶及10%分离胶SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转印，5%TBST脱脂奶粉封闭室温2 h，加入兔源ADRα2A一抗 （1∶500）4℃孵育过夜，羊抗兔二抗 （1∶5 000）室温孵育2 h，ECL法显色，Image Quant LAS 4000 mini超灵敏化学发光成像仪成像。采用Adobe Photoshop CS5软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参，以目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示ADRα2A蛋白的相对表达水平。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析及LSD法两两比较，对结果进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 免疫组化结果 免疫组化显示，模型SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A阳性黄染颗粒低于正常WKY大鼠，经单因素方差分析及LSD法两两比较，二者平均光密度值差异有统计学意义 （P=0.035＜0.05）；托莫西汀组、安神定志灵低剂量、中剂量、高剂量组的ADRα2A的阳性表达均高于模型组，差异有统计学意义 （P＜0.05），且安神定志灵中剂量组的ADRα2A蛋白表达高于托莫西汀组，差异有统计学意义 （P=0.046）。见图1、表1。

图1 WKY大鼠、SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A蛋白的免疫组化染色（×200）

表1 WKY大鼠、SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A免疫组化阳性表达水平 （，n=3）

表1 WKY大鼠、SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A免疫组化阳性表达水平 （，n=3）

注：与正常组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与托莫西汀组比较，▲P＜0.05

组别 剂量 平均光密度值（MD） F值 P值正常组 —— 0.080±0.008模型组 —— 0.069±0.004△托莫西汀组 5 mg/（kg·d） 0.080±0.009*中药低剂量组11.85 g/（kg·d） 0.082±0.008*中药中剂量组 23.7 g/（kg·d） 0.090±0.012*▲中药高剂量组47.4 g/（kg·d） 0.082±0.010*3.947 0.007

3.2 Western b1ot结果 安神定志灵对ADHD模型SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A蛋白表达的影响，见图2、表2。ADRα2A/β-actin灰度值比经单因素方差分析显示F= 197.731，P=0.000，可认为各组间ADRα2A蛋白表达水平不全相等。LSD法组间两两比较显示，模型组SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A蛋白的表达明显低于正常组WKY大鼠（P=0.011）；托莫西汀组的ADRα2A蛋白表达与模型组相比差异有统计学意义 （P=0.001），而安神定志灵低剂量、中剂量、高剂量组ADRα2A蛋白表达水平均显著优于模型组，尤以安神定志灵中剂量组的ADRα2A蛋白表达最为显著，与其他各组相比，差异均有统计学意义 （P=0.000＜0.01）。

图2 WKY大鼠、SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A蛋白表达显影

表2 WKY大鼠、SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A蛋白相对表达水平 （，n=5）

表2 WKY大鼠、SHR大鼠前额叶皮质ADRα2A蛋白相对表达水平 （，n=5）

注：与正常组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与托莫西汀组比较，▲P＜0.05

组别 剂量 ADRα2A/β-actin灰度值比 F值 P值正常组 —— 0.702±0.018模型组 —— 0.652±0.030△托莫西汀组 5 mg/（kg·d） 0.722±0.007*中药低剂量组 11.85 g/（kg·d）0.976±0.015*▲中药中剂量组 23.7 g/（kg·d） 1.065±0.022*▲中药高剂量组 47.4 g/（kg·d） 0.796±0.023*▲197.731 0.000

4 讨论

注意力缺陷多动障碍的病因及发病机制复杂，有学者认为ADHD的病理生理与中枢系统去甲肾上腺素的调节异常有关，并提出NE通路的变化可能导致ADHD前额叶环路的调节异常［6］。研究已表明，大脑内NE神经元可调节注意力、学习和记忆、情绪、意识、睡眠-觉醒周期、警觉、焦虑和疼痛等。而ADHD患儿常常存在注意力、学习和记忆、睡眠、情绪障碍等症状，这也表明NE系统与ADHD的发病关系密切。

NE通过不同的受体和信号通路，调控前额叶皮质的功能，包括α1、α2和β三类肾上腺素受体。NE对α2受体有高亲和性，而对α1受体和β受体的亲和性较低［7］。Ramos等［8］指出前额叶皮质α2受体对活动和注意力有重要作用。Arnsten等［9］指出α2肾上腺素受体包括α2A、α2B、α2C三种亚型，α2A和α2C肾上腺素受体分布广泛，包括前额叶，而α2B肾上腺素受体则在丘脑分布最多。前额叶的工作记忆功能是通过激活α2A肾上腺素受体而改善，如治疗ADHD的胍法辛即为选择性α2A肾上腺素受体激动剂［10］。越来越多的研究提出前额叶皮质α2A肾上腺素受体功能的低下可能是导致ADHD的病理机制之一，可作为ADHD的潜在药物治疗靶点［11-12］。

经过长期的临床研究，我们提出 “心肝火旺证”是ADHD主要证型，其发病机制主要是心肝火旺，阳亢阴虚，阴阳失衡，神失所藏，魂不守舍，志无所定；其治疗以“清心平肝，豁痰开窍，安神定志”为主，以达到阴平阳秘的治疗目的。安神定志灵是针对ADHD心肝火旺证而设立的，其组成为：醋柴胡，黄芩，连翘，广郁金，决明子，天竺黄，石菖蒲，钩藤 （后下），全当归，生地，益智仁，炙远志。方中黄芩、连翘清心泻火；醋柴胡、广郁金疏肝解郁散热；决明子清泄肝火，平潜肝阳，泄热通便；天竺黄清化无形之痰；钩藤平肝息风止痉；石菖蒲豁痰开窍；当归养血活血，滋润肝阴，润肠通便；生地滋补肝肾；益智仁补肾益智；炙远志祛痰开窍，宁心安神。诸药合用共奏清心平肝、豁痰开窍、安神定志之功，使心火得清，肝阳得平，肝肾得补，阴阳得调，从而消除多动、注意力不集中等症［13］。

本实验选择目前临床疗效确切的非中枢兴奋药托莫西汀作为药物对照，Bymaster等［14］提出其作用机制是通过选择性抑制去甲肾上腺素转运体，提高突触间隙NE水平来发挥治疗作用。本实验结果显示，模型组SHR大鼠前额叶皮质α2A肾上腺素受体蛋白表达明显低于正常对照WKY大鼠，说明α2A肾上腺素受体与ADHD发病有关。而托莫西汀、安神定志灵低、中、高剂量均可以显著上调α2A肾上腺素受体蛋白表达水平，且中剂量α2A肾上腺素受体蛋白表达水平高于托莫西汀，说明前额叶皮质α2A肾上腺素受体可能是安神定志灵的作用靶点之一。

［1］Po1anczyk G，de Lima M S，Horta B L，et al.The wor1dwide preva1ence of ADHD：a systematic review and metaregression ana1ysis［J］.Am JPsychiatry，2007，164（6）：942-948.

［2］韩新民，朱先康.安神定志灵治疗儿童多动症58例临床观察［J］.河北中医，2004，26（12）：898-899.

［3］刘成全，韩新民，徐建亚，等.安神定志灵对ADHD模型大鼠纹状体多巴胺转运体表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（23）：101-104.

［4］刘成全，韩新民，徐建亚，等.安神定志灵对ADHD模型鼠前额叶皮质和纹状体多巴胺D1、D2受体表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：136-139.

［5］Sagvo1den T，Russe11V A，Aase H，et al.Rodentmode1s of attention-deficit/hyperactivity disorder［J］.Biol Psychiatry，2005，57（11）：1239-1247.

［6］Kim B N，Kim JW，Kang H，etal.Regiona1differences in cerebra1perfusion associated with the a1pha-2A-adrenergic receptor genotypes in attention deficithyperactivity disorder［J］.Psychiatry Neurosci，2010，35（5）：330-336.

［7］Arnsten A F.Through the 1ooking g1ass：Differentia1noradenergicmodu1ation of prefronta1cortica1 function［J］.Neural Plast，2000，7（1-2）：133-146.

［8］Ramos BP，Arnsten A F.Adrenergic pharmaco1ogy and cognition：Focus on the prefronta1 cortex［J］.Pharmacol Ther，2007，113（3）：523-536.

［9］Arnsten A F，Scahi11L，Find1ing R L.A1pha2-Adrenergic receptor agonists for the treatmentof attention-deficit/hyperactivity disorder：emerging concepts from new data［J］.JChild Adolesc Psychopharmacol，2007，17（4）：393-406.

［10］Kim S，Bobeica I，Gamo N J，et al.Effects ofα-2A adrenergic receptor agonist on time and risk preference in primates［J］. Psychopharmacology，2012，219（2）：363-375.

［11］金国章.脑内多巴胺［M］.上海：上海科学技术出版社，2010：595.

［12］Gyires K，Zádori ZS，Török T，etal.A1pha（2）-Adrenoceptor subtypes-mediated physio1ogica1，pharmaco1ogica1 actions［J］.Neurochem Int，2009，55（7）：447-453.

［13］刘成全.韩新民从心肝火旺论治儿童多动症的经验［J］.中医药临床杂志，2007，19（3）：211-212.

［14］Bymaster F P，Katner JS，Ne1son D L，et al.Atomoxetine increases extrace11u1ar 1eve1s of norepinephrine and dopamine in prefronta1 cortex of rat：A potentia1mechanism for efficacy in attention deficit/hyperactivity disorder［J］.Neuropsychopharmacology，2002，27（5）：699-711.

R285.5

B

1001-1528（2015）08-1832-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.045

2014-04-12

国家级重点学科南京中医药大学中医儿科学科第二期开放研究课题 （EZK2012009）；江苏省2012年度普通高校研究生科研创新计划项目（CXZZ12-0613）

雷 爽 （1986—），女，医学博士，研究方向为中医药防治小儿神经精神系统疾病。Te1：（025）86617141，E-mai1：1eishuanghaohao@126.com

*通信作者：韩新民 （1957—），男，教授，主任医师，研究方向为中医药防治小儿神经精神系统疾病。Te1：（025）86798182，E-mai1：hxm1nj@163.com