γ－环糊精流动相添加剂法分离测定木瓜中的齐墩果酸和熊果酸

姚利平，杨跃清（.山西省晋中市太谷县小白乡卫生院，晋中 030802；2.天津中医药大学，天津 30093；3.陕西省中医医院肝病科，西安 70003）

γ－环糊精流动相添加剂法分离测定木瓜中的齐墩果酸和熊果酸

姚利平1，杨跃清2，3＊（1.山西省晋中市太谷县小白乡卫生院，晋中 030802；2.天津中医药大学，天津 300193；3.陕西省中医医院肝病科，西安 710003）

目的 建立木瓜中齐墩果酸和熊果酸的反相高效液相分析方法，为木瓜的质量控制提供依据。方法 色谱柱为Kromasil C18ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈－2mmol·L－1γ－CD水溶液（含1mL·L－1磷酸）（60∶40）；流速为1.0 mL·min－1；检测波长为210nm。结果 齐墩果酸和熊果酸的分离良好，分离度为3.10；齐墩果酸在0.6～3.0μg（r＝0.999 9）、熊果酸在1.2～6.0μg（r＝0.999 9）范围内线性关系良好；平均回收率分别为99.4%（RSD＝2.0%）和99.1%（RSD＝2.2%）。结论 该方法简便、准确可靠，可作为木瓜的质量控制方法。

γ－环糊精；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱法；木瓜

木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果实，药食兼用，以药用为主。药用木瓜最早载于《尔雅》，谓之懋木瓜，为传统中药。《中国药典》2010年版一部记载其味酸，性温，具有舒筋活络、和胃化湿的功效，用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节酸肿疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿［1］。现代研究表明，木瓜的化学成分主要有五环三萜及其苷类、有机酸、黄酮、甾醇、原花青素、单宁和木脂素类等［2－3］。

木瓜的质量控制主要是测定其五环三萜及其苷类的含量，如齐墩果酸和熊果酸。测定齐墩果酸和熊果酸的方法有：薄层色谱法［4］、气相色谱法［5］、液相色谱法［6－8］和毛细管色谱法［9］。齐墩果酸和熊果酸为同分异构体，普通薄层层析不易将二者分离，因此薄层色谱法测定的齐墩果酸实际上是熊果酸和齐墩果酸的总和。熊果酸和齐墩果酸的熔点比较高，需衍生化（甲酯化）后才能采用气相色谱法测定，方法较为繁琐。目前，测定齐墩果酸和熊果酸的方法最常用的方法为液相色谱法，但是，采用液相色谱法测定二者含量时，齐墩果酸和熊果酸的分离效果也较差，因此提高二者分离效果是液相色谱法测定二者含量的关键。

本文采用γ－环糊精作为流动相添加剂，以C18柱为固定相，对齐墩果酸和熊果酸进行了分离，效果良好；并建立了木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量的测定方法，为木瓜的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津公司），包括LC－10Avp泵，SPD－10Avp检测器，LC solution色谱工作站（日本岛津公司）；AB135－S电子分析天平（梅特勒托利多公司）。

1.2 试药 对照品：齐墩果酸（批号0709－9804，供含量测定用），熊果酸（批号110742－200510，供含量测定用），均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；γ－环糊精为分析纯（西安敬业生物医药科技有限公司）；水为三蒸水；其他试剂均为分析纯（西安化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18ODS（150 mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈－2mmol·L－1γ－CD水溶液（含1mL·L－1磷酸）（60∶40）；流速1.0 mL·min－1；柱温为30℃；检测波长210nm；进样体积为10μL。

2.2 对照品溶液 取熊果酸和齐墩果酸对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1mL含熊果酸300μg、齐墩果酸150μg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液 取木瓜药材60℃干燥24h，粉碎并过60目筛，精密称取药材粉末约1.0g，置于索氏提取器中，加乙醚（200mL）提取8h，40℃水浴挥干乙醚，剩余残渣用乙醇溶解，定容于25mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

2.4 系统适用性 取熊果酸和齐墩果酸的混合对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件分别进样10 μL，记录色图谱。结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置出现相同的色谱峰，齐墩果酸和熊果酸的分离度大于3.0，理论板数按熊果酸和齐墩果酸峰计算均不低于3 000，见图1。

图1 HPLC图a.混合对照品溶液；b.木瓜药材；1.齐墩果酸；2.熊果酸Fig.1 HPLC chromatogramsa.mixture reference substance solution；b.Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai；1.oleanolic acid；2.ursolic acid

2.5 线性考察 精密量取熊果酸和齐墩果酸混合对照品溶液4，8，10，12，16和20μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件检测，记录色谱图。以进样量（ng）为横坐标（C），以色谱峰面积为纵坐标（A），绘制标准曲线。结果表明，齐墩果酸和熊果酸分别在0.6～3.0和1.2～6.0μg范围内线性良好，二者的标准曲线分别为A＝81.88C－65.22（r＝0.999 9）和A＝88.31C＋162.0（r＝0.999 9）。

2.6 精密度实验 按2.1项下色谱条件，取熊果酸和齐墩果酸混合对照品溶液重复进样6次，测定熊果酸和齐墩果酸的精密度。结果表明，熊果酸和齐墩果酸二者峰面积的RSD（%）均小于2.0%，说明本方法精密度良好。

2.7 重复性实验 取同一批木瓜药材6份，照2.3项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析。结果表明，熊果酸和齐墩果酸二者含量的RSD%均小于2.0%，说明本方法重复性良好。

2.8 稳定性实验 精密量取熊果酸和齐墩果酸的混合对照品溶液10μL，分别于0，2，4，6和8h进样分析，计算齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD。结果表明，齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD小于1.5%，说明熊果酸和齐墩果酸均在8h内稳定。

2.9 回收率实验 精密称取木瓜药材（齐墩果酸含量为4.54mg·g－1，熊果酸含量为6.32mg·g－1）0.5g，加入一定量的齐墩果酸和熊果酸对照品，按供试品溶液制备方法制备成供试溶液，按2.1项下色谱条件进行分析测定，并计算加样回收率。结果表明，齐墩果酸和熊果酸的平均回收率分别为99.4%（RSD＝2.0%）和99.1%（RSD＝2.2%），说明该方法回收率良好。

2.10 样品的测定 取市售木瓜药材3批，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，采用外标法计算木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸的含量。结果表明，3批木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸的平均含量分别为4.54±0.30和6.32± 0.24mg·g－1。

3 讨论

环糊精（cyclodextrin，CD）是指淀粉用嗜碱性芽孢杆菌经培养得到的环糊精葡萄糖转位酶作用后形成的产物，是由6～12个D－葡萄糖分子以1，4－糖苷键连接而成的环状低聚糖化合物。环糊精分子中的葡萄糖单元在2位、3位有仲羟基，它们排列在圆筒形空腔的大口端；6位有伯羟基，它们位于空腔的小口端。因此，腔内具有疏水性，而腔外具有亲水性。作为流动性添加剂，环糊精空腔部分的疏水性可以与药物分子的疏水性部分发生包合作用，而药物分子中的极性基团则可以与环糊精分子空腔边缘的羟基发生氢键等极性相互作用，因此，可以用来分离同分异构体和手性药物等。常用的环糊精添加剂有β－环糊精、γ－环糊精、二甲基－β－环糊精、乙酰基－β－环糊精和磺化－β－环糊精等。本实验考察了β－环糊精、γ－环糊精、二甲基－β－环糊精对齐墩果酸和熊果酸的分离效果，结果表明，γ－环糊精作为流动相添加剂分离效果最好。

在提取溶剂上，考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯和乙醚，结果表明，乙醚作为提取溶剂时，样品溶液中杂质较少，对齐墩果酸、熊果酸的测定无干扰，基线较平，同时齐墩果酸、熊果酸提取效率也较高，因此，采用乙醚作为提取溶剂。在提取方法上，采用了浸渍、回流、超声和索氏提取4种方法，结果表明，索氏提取的提取效率最高，因而，采用索氏提取的提取方式。

《中国药典》2010年版一部木瓜药材质量标准含量测定项下要求齐墩果酸与熊果酸的总含量不得少于0.50%，本实验3批木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸的平均含量分别为4.54和6.32mg·g－1，高于《中国药典》要求。

［1］ 国家药典委员会.中国药典2010年版［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：57.

［2］ 敖志辉，陈建真.中药木瓜的化学成分和质量控制研究进展［J］.海峡药学，2008，20（12）：79－81.

［3］ 高慧媛，吴立军，黑柳正典.光皮木瓜的化学成分［J］.中国天然药物，2003，1（2）：82－84.

［4］ 刘亚蓉.薄层扫描法测定藏药晶珠肝泰舒胶囊中齐墩果酸的含量［J］.西北药学杂志，2003，18（3）：104－105.

［5］ 周静，刘垣升.气相色谱法测定女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.中国新药与临床杂志，2003，22（10）：596－598.

［6］ 王嫦鹤，张秉华，刘芳，等.HPLC法同时测定山楂中的山楂酸、齐墩果酸和熊果酸［J］.西北药学杂志，2011，26（1）：35－37.

［7］ 王雨梅，杜瑞芳，刘卫东，等.HPLC法同时测定毛建草中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.西北药学杂志，2008，23（2）：84－85.

［8］ 冯瑜娟，张艺.HPLC－ELSD法测定藏药翼首草中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.成都中医药大学学报，2007，30（3）：54－56.

［9］ 王瑞，王淑美，梁生旺，等.胶束电动毛细管色谱法分离分析山茱萸中齐墩果酸和熊果酸［J］.中药材，2007，30（8）：946－950.

Separation and determination of oleanolic acid and ursolic acid in Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai usingγ－cyclodextrin as the mobile phase modifier

YAO Liping1，YANG Yueqing2，3＊（1.White Township Hospital of Taigu County of Jinzhong in Shanxi Province，Jinzhong 030802，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Department of Hepatopathy，Chinese Medicine Hospital of Shaanxi Province，Xi′an 710003，China）

Objective To establish a reversed－phase high performance liquid chromatography method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai，and provide a basis for the quality control of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.Methods The analytical column was KromasilC18ODS（150mm×4.6mm，5μm）and the mobile phase was acetonitrile－2mmol·L－1γ－CD containing 1mL·L－1phosphoric acid（60∶40）.The flow rate was 1.0mL·min－1.The detection wavelength was 210nm.Results A baseline separation of oleanolic acid and ursolic acid was obtained，and the resolution factor was 3.10.The linearity of the method was excellent（r＝0.999 9）over the studied range of 0.6－3.0μg for oleanolic acid，and 1.2－6.0μg for ursolic acid.The recoveries were 99.4%for oleanolic acid（RSD＝2.0%）and 99.1%for ursolic acid（RSD＝2.2%）.Conclusion The method was proved to be simple，accurate and precise，and can be applied for the quality control of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.

γ－cyclodextrin；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC；Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.007

R282

A

1004－2407（2015）02－0128－04

2014－07－29）

姚利平，女，药师

＊通信作者：杨跃清，男，主治医师