新疆葡萄树伤流液皂苷的含量测定

黄 琼，刘 玲，艾尔肯·依不拉音★（.新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 8300；2.新疆埃乐欣药业有限公司，乌鲁木齐 8300）

·中药及天然药物·

新疆葡萄树伤流液皂苷的含量测定

黄 琼1，2，刘 玲1，艾尔肯·依不拉音1★（1.新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 830011；2.新疆埃乐欣药业有限公司，乌鲁木齐 830011）

目的 对新疆葡萄树伤流液皂苷含量进行测定。方法 采用化学法和TLC法对新疆葡萄树伤流液中皂苷进行定性鉴别，采用香草醛－冰醋酸法测定新疆葡萄树伤流液的皂苷含量。结果 新疆葡萄树伤流液含有一定的皂苷，不同品种、不同产地葡萄树伤流液的皂苷含量不同，其中吐鲁番卡西克葡萄树伤流液中皂苷含量最高（106.00μg·mL－1），和田市红葡萄树伤流液中皂苷含量最低（6.50μg·mL－1）。结论 新疆葡萄树伤流液因产地和品种的不同，其皂苷含量也不同。

新疆葡萄树伤流液；皂苷；TLC；香草醛－冰醋酸法

每年的4月上旬至中旬，干燥无雨，气温相对较高，葡萄属（Vitis L.）葡萄（Vias vinifera L.）植株从其伤口处会自动流出无色透明的液体即葡萄树伤流液［1］。本课题组在前期的工作中，采用自建的羟自由基（·OH）体系检测并研究比较新疆不同产地葡萄树伤流液的体外抗氧化活性，结果表明，新疆葡萄树伤流液具有较强的抗氧化活性，特别是对·OH的清除能力较强，且葡萄树伤流液对·OH清除率具有较强的热稳定性，甚至可耐95℃的高温［2］。相关研究［3－6］表明，绞股蓝皂苷、人参皂苷、文冠果果壳皂苷、油茶皂苷等植物皂苷均有比较强的抗氧化作用，其他植物或海洋生物中的皂苷也有一定的生物活性，而皂苷是否是新疆葡萄树伤流液的抗氧化活性物质需进一步分析。因此，本实验采用化学法和薄层色谱法（TLC）对新疆葡萄树伤流液是否含有皂苷进行鉴别，采用香草醛－冰醋酸法对葡萄树伤流液的皂苷含量进行了测定，为将其开发成天然抗氧化剂提供理论依据和实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV－2550型紫外可见分光光度计（日本Shimadu公司）；Linomat 5型薄层色谱点样仪、Re－prostar 3型薄层色谱摄像仪、Heater 3型薄层色谱加热仪（瑞士CAMAG公司）；N－1001型旋转蒸发仪、CA－1111型冷却水循环装置、SB－1000型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵（上海科恒实业发展有限公司）；AEL－160型电子天平（日本Shimadu公司）；HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 材料 葡萄树伤流液于2013年4月初分别在新疆吐鲁番鄯善县、和田市、和田县、喀什市和阿图什市采集，冷冻保存，原植物即葡萄品种由新疆医科大学帕丽达·阿不力孜教授鉴定。

齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110709－201206）；香草醛（上海阿拉丁试剂有限公司）；茴香醛（天津市光复精细化工研究所）；醋酐（天津市辰光化工有限公司）；氯仿（西安化学试剂厂）；乙酸乙酯（天津市富宇精细化工有限公司）；冰乙酸（天津市化学试剂研究所）；浓硫酸（西安化学试剂厂）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司）；甲醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；无水乙醇（天津市永晟精细化工有限公司）；实验用水为二次重蒸水。

硅胶高效G板（青岛海洋化工厂分厂，10cm× 20cm，批号20120812）。

2 实验方法

2.1 样品溶液的制备 新疆吐鲁番鄯善县、和田市、和田县、喀什市和阿图什市葡萄树伤流液，经50℃减压浓缩20倍左右，进行皂苷化学、TLC和含量测定实验。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品10.10mg，用无水乙醇定容于10mL棕色量瓶中，此为储备液。精密吸取储备液1mL，用无水乙醇定容于10mL棕色量瓶中，即得101μg·mL－1的齐墩果酸对照品溶液。

2.3 皂苷化学实验

2.3.1 泡沫实验 在试管中加入不同品种、不同产地葡萄树伤流液2mL，强烈振摇1min后放置，观察泡沫持续时间。

2.3.2 醋酐－浓硫酸实验 取不同品种、不同产地葡萄树伤流液20倍左右的浓缩液2mL，于蒸发皿中减压干燥，加入1mL醋酐使其溶解，缓慢加入浓硫酸1滴，观察颜色变化。

2.4 皂苷TLC实验

2.4.1 展开系统 皂苷：氯仿－冰乙酸－甲醇－水＝60∶32∶12∶8；三萜苷：氯仿－甲醇－水＝64∶50∶10［7］。

2.4.2 点样量 采用自动点样法，取2μL进行薄层定性实验。

2.4.3 显色系统 本实验采用茴香醛－硫酸显色剂进行显色。配制方法［7］：在冰浴条件下，于85mL甲醇与10mL冰乙酸中，先后加入5mL浓硫酸和0.5 mL茴香醛，即得。薄层板显色后于105℃加热5 min，可见光下进行观察。

2.5 香草醛－冰醋酸法测定皂苷含量

2.5.1 测定波长的确定 分别吸取0.4mL齐墩果酸对照品溶液和20μL喀什木纳格葡萄树伤流液浓缩液于试管中，90℃水浴挥干溶剂，按标准曲线项下的方法，在200～800nm波长范围内进行波谱扫描，从而确定测定波长。

2.5.2 标准曲线的制备 精密吸取齐墩果酸对照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7和0.8mL，置于试管中，90℃水浴挥干溶剂，加入0.5mL·L－1香草醛冰乙酸溶液0.2mL，再加入高氯酸溶液0.8mL，70℃水浴15min，取出，流水冷却10min，使之反应完全。加入4mL乙酸乙酯，摇匀，随行试剂作空白，于最大吸收波长处测定吸光度［8－11］。绘制标准曲线，并按最小二乘法计算回归方程。

2.5.3 样品的测定 精密吸取样品溶液40μL，置于试管中，挥干溶剂，按标准曲线项下的方法测定吸光度。根据标准曲线回归方程，以齐墩果酸为基准计算总皂苷的含量。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 稳定性实验 精密吸取喀什木纳格葡萄树伤流液浓缩液20μL，按标准曲线项下的方法，每隔10min测定一次吸光度，计算RSD值。

2.5.4.2 重复性实验 精密吸取6份喀什木纳格葡萄树伤流液浓缩液20μL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，计算RSD值。

2.5.4.3 精密度实验 精密吸取6份齐墩果酸对照品溶液0.4mL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，计算RSD值。

2.5.4.4 加样回收率实验 分别吸取一定量的喀什木纳格葡萄树伤流液浓缩液，加入适量的齐墩果酸对照品溶液，按标准曲线项下的方法测定吸光度和质量，计算其回收率和RSD值。

3 结果

3.1 皂苷化学实验结果 由泡沫实验结果可知，泡沫持续10min以上，而醋酸－浓硫酸实验中颜色的变化是黄→红→紫→蓝，说明有皂苷的存在，且可能是三萜皂苷。

3.2 皂苷TLC实验结果 由新疆葡萄树伤流液中皂苷和三萜皂苷的薄层鉴别结果可知，伤流液中除和田市红葡萄伤流液和阿图什木纳格葡萄树伤流液外，均有一定的皂苷和三萜皂苷，需采用其他方法进行定量分析。

3.3 皂苷含量测定结果

3.3.1 检测波长的确定 齐墩果酸对照品溶液在548nm处有最大吸收，因此选择548nm作为测定波长。

3.3.2 标准曲线和回归方程的建立 按2.5.2项下方法测定不同质量齐墩果酸对照品溶液的吸光度，按最小二乘法计算得回归方程为：A＝0.008 5C－0.009 9，r＝0.999 9，表明样品质量在0～80.8μg范围内与吸光度线性关系良好。

3.4 方法学考察实验

3.4.1 稳定性实验 稳定性实验结果表明，随着时间的增加，虽然测定结果有所上升，但在1h内基本稳定，其RSD为1.5%，表明该方法稳定性好。

3.4.2 重复性实验 重复性实验的RSD为0.81%，表明该方法重复性好。

3.4.3 精密度实验 精密度实验的RSD为0.83%，表明该方法精密度好。

3.4.4 加样回收率实验 结果见表1。结果表明，试样加样平均回收率为100.2%，RSD为2.6%，可以保证测定结果的可靠性。

表1 加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery experiment （n＝3）

3.4.5 新疆葡萄树伤流液皂苷含量的测定 不同品种、不同产地新疆葡萄树伤流液的皂苷含量见表2。

表2 新疆葡萄树伤流液的皂苷含量Tab.2 Saponin contents of Xinjiang GBS

由表2可知，不同品种、不同产地新疆葡萄树伤流液的皂苷含量不同，表现为：吐鲁番卡西克伤流液＞喀什木纳格伤流液＞和田萨依巴格乡红葡萄伤流液＞阿图什木纳格伤流液＞吐鲁番马奶子伤流液＞和田色格孜乡红葡萄伤流液＞吐鲁番无核白伤流液＞和田木纳格伤流液＞和田市红葡萄伤流液，可见差异较大。

4 讨论

在对新疆葡萄树伤流液进行化学定性分析和TLC鉴别时，需对样品进行浓缩才能出现相应的颜色和斑点，说明原液中皂苷含量较低。薄层板点样前需105℃活化30min，层析缸与薄层板需饱和30min，否则容易出现边缘效应和斑点拖尾现象。采用茴香醛－浓硫酸显色剂进行显色时，浸染方式相对稳定，但浸染时间不能过长，否则斑点会出现溶解现象。

虽然点样量都是2μL，和田市红葡萄树伤流液和阿图什木纳格葡萄树伤流液在与其他品种葡萄树伤流液相应位置处没有出现斑点，由此可以说明这2种伤流液中皂苷含量极低，皂苷的确切含量需采用更加准确的定量方法，如香草醛－冰醋酸法等。

本文采用香草醛－冰醋酸法测定新疆不同产地、不同品种葡萄树伤流液皂苷含量。吐鲁番地区的3个品种中，卡西克伤流液的皂苷含量明显高于马奶子伤流液和无核白伤流液的含量。对其活性稳定性探讨时，卡西克伤流液的稳定性有同样的趋势，两者有无联系有待进一步探讨；和田地区3个地方的红葡萄树伤流液因为采集地点相距较远，皂苷含量差异较大；且3个地方的木纳格伤流液也有相似的分布情况。由此可以看出，对于新疆葡萄树伤流液的皂苷含量来说，产地和品种对其都有影响。

本实验对新疆葡萄树伤流液的蛋白和皂苷含量［12］分别进行了测定，发现两者之间的关联并不大。以喀什木纳格伤流液为例，其皂苷含量为75.5 μg·mL－1，仅次于吐鲁番卡西克伤流液（106.00 μg·mL－1），而其蛋白含量则最低，为2.96μg·mL－1。这说明新疆葡萄树伤流液中皂苷含量与蛋白含量不成正相关关系。

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Determination of saponin in bleeding sap from Xinjiang grape tree

HUANG Qiong1，2，LIU Ling1，Arkin IBURAIM1﹡（1.Central Laboratory，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Ailexin Pharmaceutical Limited Company，Urumqi 830011，China）

Objective To determine the contents of saponin in Xinjiang grapevine bleeding sap（GBS）.Methods The qualitative identification was performed by chemical methods and TLC，and the saponin contents were determined by vanillin－perchloric acid assay.Results Xinjiang GBS contained certain amounts of saponin.Turpan Kashyyyk GBS（106.00μg·mL－1）was the highest and Hotan red grape GBS（6.50μg·mL－1）was the lowest.Conclusion Results showed that Xinjiang GBS from different origins and varieties had different saponin contents.

Xinjiang grapevine bleeding sap；saponin；TLC；vanillin－perchloric acid method

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.001

R284

A

1004－2407（2015）02－0111－03

2014－09－12）

国家自然科学基金项目（编号：21162030）

黄琼，女，在读硕士研究生

＊通信作者：艾尔肯·依不拉音，男，教授，博士生导师