慢性丙型肝炎中医证型与HCV 1b亚型NS5A aa变异、IL28B SNP的关系

李京涛，魏海梁，席 奇，刘亚珠，闫曙光，惠 毅，宋春荣，宁春茜，常占杰

(1.陕西中医学院附属医院，陕西咸阳712000;2.陕西中医学院，陕西咸阳712000)

聚乙二醇化干扰素(pegylated interferon，PEGIFN)联合利巴韦林(Ribavirin，RBV)治疗是目前慢性丙型肝炎(CHC)患者的标准抗病毒方案。但此方案对HCV lb亚型的疗效不佳，持续病毒学应答率(SVR)仅约55%［1］。结合病毒和宿主两方面的关键因素分析，HCV 1b亚型病毒株基因NS5A蛋白多个区域的氨基酸(amino acid，aa)序列突变数目与IFN、IFN/RBV 的疗效 有关，这 些 区域 包 括 ISDR［2］、PKRBD［3］、V3［4］、IRRDR［5-6］;而 人 19 号 染 色 体，IL28B上游rs12979860和rs8099917基因位点单核苷酸多态性(SNP)与抗病毒治疗的SVR密切相关［7-9］。中医药在慢性丙型肝炎的临床诊疗中发挥着重要作用［10-11］。传统的中医辨证论治是通过对四诊所收集的资料，进行归纳分析、综合，概括、判断为某种证，并确立相应的治疗方法。但是，慢性肝病的证候演化复杂多变，在众多“显性证候”之外，更多的是“隐性证候”［12］，因此，开展慢性肝病的证候客观量化研究符合现代中医药临床和科研发展的趋势。笔者探索性地将慢性丙型肝炎的传统中医分型与影响HCV 1b亚型抗病毒疗效的NS5A aa变异、IL28B SNP检测结果进行统计分析，探讨其是否存在相关性。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 58例慢性丙型肝炎患者均为2012年7月—2014年7月在陕西中医学院附属医院门诊及住院的患者。纳入标准和排除标准参考《丙型肝炎防治指南》［1］中的慢性丙型肝炎:HCV感染超过6个月，或发病日期不明、无肝炎史，但肝脏组织病理学检查符合慢性肝炎，化验结果显示HCV RNA＞1 000 U/mL(深圳匹基)，抗-HCV阳性。入组的患者均需经过治疗前评估:包括患者的年龄、性别、感染途径等。

1.2 研究方法 慢性丙型型病毒性肝炎中医辨证标准参照“国家十一五科技重大专项课题”结果［13］，将慢性丙型肝炎患者中医证型概括为以下6种:正虚邪恋、脾肾阳虚、湿热中阻、肝郁脾虚、肝肾阴虚和瘀血阻络。辨证分型结论由2位主治医师共同判断，并由1位主任医师审核确定。

1.3 观察指标 1)肝脏生化指标:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总胆红素(TBIL)。由HITACHI 7600-020全自动生化分析仪完成。2)HCV RNA:采用实时荧光定量PCR法检测血清HCV RNA定量，仪器为ABl7300，试剂由深圳匹基基因公司提供，检测下限为1 000 U/mL。3)HCV基因分型:HCV-1b亚型按文献［14］方法确定。4)HCV NS5A的扩增和序列比对:RT-PCR检测患者血清中HCV NS5A片段，RT-PCR反应条件和引物采用笔者已经建立的方法［15］。阳性产物经纯化后送上海英骏公司测序。测序结果经MEGA 4软件进行DNA序列比对，参考序列为HCV 1b原始株(HCV J，Gen-Bank 90208)，继之转换成 NS5A aa序列(aa 2209-2379)，分析 ISDR、PKRBD、V3、IRRDR 和 NS5A(ISDRV3)区突变情况。5)IL28B SNP检测:采用四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，TARMS-PCR)扩增rs8099917，扩增产物结果进行电泳鉴定，具体PCR引物和反应条件采用已建立的方法［16］。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，中医分型多组的差异比较采用One WAY-ANOVA检验，进一步的多重比较采用LSD法。方差不齐时，选择近似F检验Welch法;计数资料采用频数和百分数描述，其差异比较采用χ2检验;所有统计采用双侧检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性丙型肝炎中医证型分布情况，本研究结果和陈建杰等［14］多中心、大样本流行病学研究数据基本一致，见表1。

表1 慢性丙型肝炎中医证型分布 例

2.2 慢性丙型肝炎中医证型与患者基线情况、肝功能、HCV RNA比较情况 见表2。

2.3 不同证型与NS5A蛋白各区段aa变异、IL28B SNPs比较情况 见表3。

表2 不同证型的基线情况比较

表3 不同证型的NS5A aa变异和IL28B SNPs比较(±s)

表3 不同证型的NS5A aa变异和IL28B SNPs比较(±s)

证 型 例数 ISDR PKRBD V3 IRRDR NS5A(ISDR-V3)IL28B(TT/TG)正虚邪恋 25 0.88 ±0.73 5.52 ±1.20 4.72 ±1.28 5.80 ±1.50 17.20 ±2.06 18/7脾肾阳虚 5 0.60 ±0.89 5.60 ±0.89 5.00 ±1.00 5.80 ±1.79 17.60 ±2.89 3/2湿热中阻 9 1.44 ±1.74 6.22 ±2.22 5.22 ±1.09 6.00 ±1.41 18.00 ±3.00 9/0肝郁脾虚 13 0.77 ±0.73 5.46 ±1.33 4.38 ±1.04 5.15 ±1.57 15.46 ±3.36 11/2肝肾阴虚 3 1.00 ±0.00 6.00 ±0.00 5.00 ±0.00 6.00 ±0.00 18.67 ±1.15 3/0瘀血阻络 3 1.33 ±0.58 5.67 ±1.16 6.00 ±1.00 6.67 ±1.16 18.00 ±2.65 3/0 F/χ2 0.842 0.434 1.322 0.719 1.549 7.221 P 0.526 0.823 0.269 0.612 0.191 0.205

3 讨论

慢性丙型肝炎本虚邪恋型的主要症状为乏力、面色无华、小便黄、口干、腹胀等，弦脉、淡红舌、白苔或腻苔，而慢性丙型肝炎的临床特点是大多数患者无明显临床症状，且血清丙氨酸转移酶(ALT)正常或轻度升高，但是HCV在肝细胞内持续复制，造成肝组织学的炎症损害和纤维化缓慢进展［17］。由于这些临床表现均为非特异性的症状和体征，所以常常容易被忽视和漏诊。本研究显示慢性丙型肝炎的中医证型中，本虚邪恋型占43.1%，提示应该重视对丙型肝炎的临床筛查和研究。

本研究结果显示慢性丙型肝炎中医证型与患者年龄和球蛋白有关。不同中医证型组间患者的年龄从小到大依次排列为:肝郁脾虚＜湿热中阻＜正虚邪恋＜脾肾阳虚＜瘀血阻络＜肝肾阴虚，提示肝郁脾虚型多见于年轻患者，瘀血阻络型和肝肾阴虚型多见于中老年患者。肝病患者球蛋白水平升高说明HCV感染存在的时间长，累积的肝纤维化程度较重［18］。不同中医证型组间患者的球蛋白水平从低到高依次排列为:肝郁脾虚＜正虚邪恋＜肝肾阴虚＜湿热中阻＜脾肾阳虚＜瘀血阻络，提示肝郁脾虚型的肝纤维化较轻，而脾肾阳虚和瘀血阻络型肝纤维化较重。

HCV 1b亚型NS5A aa变异以及IL28B SNPs均与以干扰素为基础的抗病毒治疗应答效果密切相关。HCV NS5A位于HCV基因组nt 6258-7601区域，编码447个氨基酸，是高度磷酸化的非结构蛋白，其中ISDR、PKR、V3、IRRDR 和 NS5A(ISDR-V3)区的氨基酸突变可以影响抗病毒治疗的SVR［2-6］。本研究发现中国陕西地区HCV 1b亚型CHC患者的NS5A氨基酸突变与中医分型无相关性。2009年，Ge.D等［7］采用全基因组关联分析(Genome Wide Association Studie，GWAS)方法，发现人19号染色体，IL28B上游的SNP位点rs12979860基因型明显与基因1型抗病毒治疗的 SVR 有关。同年 Suppiah，V［9］和 Tanaka.Y等［10］在nature发表IL28B另一 SNP位点 rs8099917的研究结果。由于此两个SNP位点具有很强的连锁不平衡［16］，所以检测任一个位点即可。本研究显示中国陕西地区IL28B SNP位点rs8099917以TT型为主，占81.03%(47/58)，TG 型占 18.97%(11/58)，未发现GG型，数据与之前对华南地区的研究一致［16］。但未发现慢性丙型肝炎患者中医分型与NS5Aaa突变和IL28B SNP具有相关性。

总之，慢性丙型肝炎的中医证候客观量化研究有利于现代中医、中西医的临床实践和科研创新［19-20］。本研究结果显示慢性丙型肝炎中医证型中，正虚邪恋型最多，结合年龄和球蛋白水平分析，肝郁脾虚型多见于年轻患者，且肝纤维化程度较轻，而瘀血阻络型和脾肾阳虚型多见于中老年患者，肝纤维化程度较重，而慢性丙型肝炎中医证型与HCV RNA、NS5A aa变异以及IL28B SNP无关，限于例数较少，这一结论需要后续大样本的研究进一步证实。

［1］中华医学会肝病学分会，中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南［J］.中华传染病杂志，2004，22(2):131-136.

［2］ENOMOTO N，SAKUMA I，ASAHINA Y，et al.Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis C virus 1b.Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substitutions in the NS5A region［J］.The Journal of Clinical Investigation，1995，96(1):224-230.

［3］GALE M J，KORTH M J，TANG N-m，et al.Evidence that hepatitis C virus resistance to interferon is mediated through repression of the PKR protein kinase by the nonstructural 5A protein［J］.Virology，1997，230(2):217-227.

［4］VEILLON P，PAYAN C，GAUDY C，et al.Mutation analysis of ISDR and V3 domains of hepatitis C virus NS5A region before interferon therapy with or without ribavirin［J］.Pathologie Biologie，2004，52(9):505-510.

［5］EL-SHAMY A，NAGANO-FUJII M，SASASE N，et al.Sequence variation in hepatitis C virus nonstructural protein 5A predicts clinical outcome of pegylated interferon/ribavirin combination therapy［J］.Hepatology(Baltimore，Md.)，2008，48(1):38-47.

［6］EL-SHAMY A，SHOJI I，SAITO T，et al.Sequence heterogeneity of NS5A and core proteins of hepatitis C virus and virological responses to pegylated-interferon/ribavirin combination therapy［J］.Microbiology and Immunology，2011，55(6):418-426.

［7］GE DONGLIANG，FELLAY J，THOMPSON A J，et al.Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance［J］.Nature，2009，461(7262):399-401.

［8］SUPPLIAH，V.IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy［J］.Nature Genetics，2009，41(10):1100-1104.

［9］SUPPIAH V，MOLDOVAN M，AHLENSTIEL G，et al.IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-α and ribavirin therapy［J］.Nature genetics，2009，41(10):1100-1104.

［10］TANAKA Y，NISHIDA NAO，SUGIYAMA M，et al.Genomewide association of IL28B with response to pegylated interferonalpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C［J］.Nature Genetics，2009，41(10):1105-1109.

［11］王成宝，聂红明，李弘町，等.慢性丙型肝炎的中医学研究进展［J］.辽宁中医杂志，2011，38(4):795-797.

［12］曹静静，薛博瑜.中医药治疗丙型肝炎的研究［J］.长春中医药大学学报，2012，28(1):71-73.

［13］李瀚旻.慢性肝病“肝肾精虚”证的客观量化标准［J］.世界科学技术—中医药现代化，2013，15(6):1429-1432.

［14］陈建杰，聂红明，王成宝，等.中国慢性丙型肝炎中医证候的多中心、大样本流行病学研究［C］//中华中医药学会全国第十四次肝胆病学术会议论文汇编，2010.

［15］李京涛，魏君锋，周元平，等.HCV1b亚型ISDR变异影响PEG-IFN/RBV抗病毒疗效的新特点分析［J］.热带医学杂志，2012，12(1):7-11.

［16］李京涛，周斌，周元平，等.华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析［J］.南方医科大学学报，2012，32(1):46-49.

［17］LI Wei，ZENG Yanli，WANG Junjie，et al.Predicting sustained viral response to hepatitis C using a rapid and simple IL28B rs8099917 genotyping assay［J］.Antiviral Research，2012，94(1):54-56.

［18］庄辉.重视丙型肝炎的研究［J］.中华肝脏病杂志，2004，12(2):65-66.

［19］应豪，周文红.常用血清学指标与慢性乙型肝炎肝纤维化程度相关性研究［J］.中西医结合肝病杂志，2007，17(1):10-11.

［20］李京涛，常占杰，席奇，等.HCV细胞培养系统及其在中草药提取物抗HCV研究中的应用［J］.临床肝胆病杂志，2015，31(1):115-117.