橙皮苷抑制JNK信号通路辅助治疗2型糖尿病大鼠

殷章红，罗鹏程，王才英

(黄石市中心医院肾内科，湖北黄石435000)

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是哺乳类动物丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成员之一，其在体内可以使得某些没有活性的蛋白中的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，进而使得这些蛋白发挥相应的功能。目前多数研究［1-2］认为，JNK信号通路中的调节酶类参与了肥胖、胰岛素抵抗以及2型糖尿病等疾病的发生和发展。橙皮苷在药学上又称之为陈皮甙、桔皮甙，其是橙皮、柠檬中提取的一种苷类活性物质，临床研究［3］表明橙皮苷具有较强的抗氧化能力。本文拟用橙皮苷治疗2型糖尿病大鼠，着重分析治疗后对JNK信号通路的特点，以探讨其是否可以作为一种辅助治疗2型糖尿病的药物。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠36只，大鼠体质量(190±10)g，由广东药学院实验动物中心提供(合格证号:26-2003A003)。橙皮苷购自四川康嘉生物科技有限公司。JNK、P-JNK多克隆抗体、相应二抗、β-actin单克隆鼠抗体购自美国Santa Craze公司;多克隆抗体Caspase-6抗体购自圣克鲁斯生物技术公司;逆转录试剂盒购自北京天根生物公司。

1.2 模型建立及大鼠分组 40只大鼠随机分为空白对照组12只，模型组14只以及橙皮苷治疗组14只，造模时空白对照组给予其正常饲料喂养，模型组和橙皮苷治疗组给予日常高脂饲料(普通饲料78.8%，胆固醇1%，牛胆盐0.2%，蛋黄粉10%，猪油10%)饮食加高浓度红糖水(5%)饮用，6个月后用血糖仪测定血糖，测定时随机选取大鼠，连续3 d，大鼠血糖含量均大于11.1 mol/L时确认造模成功。

1.3 标本收集 治疗组给予橙皮苷200 mg/kg大鼠体质量灌胃，模型组给予生理盐水1 mL灌胃对应比较，对照组不给于任何干涉，治疗8周后大鼠颈椎脱臼处死，之后用剪刀沿大鼠腹中线切开，取肝脏组织置超低温冰箱保存。

1.4 免疫组化 JNK、P-JNK免疫组化交由广东药学院病理学院完成，Caspase-6免疫组化由我院病理科完成，具体方法参照PV.9000二步法免疫组织化学试剂盒说明书，肝脏组织在用4%的多聚甲醛固定后，分别用15%和25%的蔗糖溶液梯度脱水24 h，冰冻切片后用3%H2O2阻断，血清封闭，之后分别滴加1∶200稀释的克隆一抗，4℃孵育过夜，第2天滴加相应二抗和辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育10 min后，DAB显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明即完成，最后显微镜观察并保存图像，观察分析结果。

1.5 Western Blot检测 取1 g肝脏组织，磨碎后提取上清液离心提取上清液，蛋白定量，取各样本100 μg行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，暗室内曝光洗片，扫描仪扫描胶片图像、Image J计算各灰度值，βactin作内参对照。

1.6 逆转录聚合酶链反应 用总RNA提取试剂盒提取肝脏组织中总RNA，逆转录获得cDNA。JNK基因上游引物:5’-ACAGTGAGCAGAGCAGGCATAGTG-3’。下游引物:5’-TCCTCCCCAAA CAAA-ATAGAACCA-3’，产物为520bp;P-JNK基因上游引物:5’-TCAGGCAGT AGCACCGCGA-GAGTA-3’。下游引物:5’-GCATGCACCAGATACTACGACCG-3’，产物为 436bp;Caspase-6基因上游引物:5’-GCGGTGAGCAAGTGGCAGCCAGTG-3’。下游引物:5’-TCTACCGTAC AGAGTGATAAAGCA-3’，产物为 356 bp;β-actin 基因上游引物:5’-CAGGTCCA-GACGCAGGATGGC-3’。下游引物:5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’，产物为 270 bp。取5 μL cDNA和相应引物扩增，扩增条件为预变性5 min，扩增40次，扩增完成后直接凝胶电泳，收集图像后，Image J计算各灰度值，β-actin作内参对照。

1.7 统计学分析 全部数据均用SPSS 19.0统计软件处理，多组样本均数比较采用单因素方差分析及t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化 免疫组化JNK、P-JNK、Caspase-6，其对照组肝组织内几乎未见棕色颗粒。模型组肝组织内棕色颗粒明显增多;橙皮苷治疗组肝组织内棕黄色颗粒较模型组减少，但仍然较高。

2.2 RT-PCR RT-PCR结果可以明显的看出，JNK、P-JNK以及Caspase-6空白组表达较低，经橙皮苷治疗后，3个蛋白表达有一定的降低，明显低于模型组(P＜0.05)，但与空白组仍然有较远的差距(P＜0.05)。

2.3 Western blot Western blot与RT-PCR结果一致，JNK、P-JNK以及Caspase-6空白组表达较低，经橙皮苷治疗后，3个蛋白表达有一定的降低，明显低于模型组(P＜0.05)，但与空白组仍然有较远的差距(P＜0.05)。

2.4 胰岛素抵抗指数 胰岛素抵抗指数比较，橙皮苷治疗后，明显低于模型组(P＜0.05)，但与空白对照组相比，仍有一定的差距(P＜0.05)，见图1。

图1 治疗后大鼠胰岛素抵抗指数的表达

3 讨论

2型糖尿病是临床中最为常见的一种代谢性疾病，近年来随着人们生活水平的提高，本病的发生率逐年升高［4］。有研究［5］显示，本病在我国发病人数已超过9 000万。2型糖尿病最典型的特征为胰岛素抵抗(IR)的升高，此病虽机体内胰岛素可以正常产生，但是由机体对其敏感性降低所产生［6］。主要是由于胰岛素受体底物以及磷脂酰肌醇3激酶途径发生异常在葡萄糖转运中起到关键作用，而JNK信号通路属于本转运通路的一环，与IR的发生密切相关［7］。大量动物实验［8-9］发现，不管在高脂饮食诱导的还是基因敲除(ob/ob)的肥胖鼠中，其胰岛素作用的靶器官肝脏、骨骼肌、脂肪组织中JNK活性均明显增高，而激活JNK使其磷酸化活性形式的表达也明显升高。JNK在体内可以使得某些没有活性的蛋白中的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，进而使得这些蛋白发挥相应的功能。目前多数研究［1-2］认为，JNK信号通路中的调节酶类参与了肥胖、胰岛素抵抗以及2型糖尿病等疾病的发生和发展。

橙皮苷在摄入人体后，有维持血液渗透压，增强毛细血管韧性作用，同时还有降低胆固醇，调节脂代谢的作用［10］。目前本药多用于心血管系统疾病的辅助治疗，具有明显的预防动脉粥样硬化以及预防心肌梗死的作用［11］。研究中用橙皮苷治疗2型糖尿病大鼠，着重分析治疗后对JNK信号通路的影响，以探讨其是否可以作为一种辅助治疗2型糖尿病的药物。研究结果显示，橙皮苷治疗后大鼠肝脏免疫组化、蛋白以及 mRNA JNK、P-JNK、Caspase-6表达，3个指标均有一定的降低，明显低于模型组(P＜0.05)，但与空白组仍然有较远的差距(P＜0.05)。胰岛素抵抗指数与蛋白表达结果基本一致。

综上提示:橙皮苷可改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数，其可能是通过抑制JNK信号通路的活性，减少JNK、p-JNK以及Caspase-6表达实现的，但橙皮苷降低上述酶及表达幅度较小，今后可用于辅助用药。

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［3］赵珉，张楠楠，王红.微波法提取陈皮中橙皮苷方法研究［J］.长春中医药大学学报，2011，27(5):858-859.

［4］HAJIANFAR H，PAKNAHAD Z.The effect of omega-3 supplements on antioxidant capacity in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Technology ＆ Therapeutics，2013，15(1):A125-A126.

［5］佚名.我国已经成为糖尿病大国［J］.上海医药，2012，33(4):33.

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［11］张冬松，高慧媛，吴立军.橙皮苷的药理活性研究进展［J］.中国现代中药，2006，8(7):25-27.