冠心舒通胶囊对急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影响

姜丽红，吴成哲

(1.长春中医药大学附属医院心内科，长春130021;2.长春中医药大学基础医学院研究生，长春130117)

冠心舒通胶囊系蒙古民间验方［1］，临床用于治疗心血瘀阻型冠心病所引起的胸痛、胸闷、心慌、气短等症，临床研究证实其具有较好的抗心绞痛作用，实验研究也证实其具有抗心肌缺血、抗缺氧、降脂等作用。本文通过观察冠心舒通胶囊对心肌梗死后大鼠缺血心肌组织VEGF、PDGF表达的影响，探讨冠心舒通胶囊对急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管生成的作用。

1 材料

1.1 动物 健康Wistar大鼠(吉林大学实验动物技术有限公司提供，批号:SCXK(吉)-2013-0001)，75只，体质量(200±30)g，实验前正常喂养1周。

1.2 仪器 RSP-1002型动物呼吸机(江西特立麻醉呼吸设备公司)、心电示波仪(Sigma美国公司)、电子天平、恒温水浴锅(北京六一科技公司)、微量加样器(芬兰GILSON公司)、组织研磨器(德国蔡司公司)、低温高速离心机电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统(Bio-Rad美国公司)、PCR仪、荧光定量PCR仪、紫外分光光度计(Sigma美国公司)。

1.3 药物与试剂 冠心舒通胶囊(步长制药集团，批号:140507)、注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，批号:D0801320)、生理盐水(吉林仙鹤草药业有限公司)、肝素钠注射液引物(中国江苏常州生化千红制药有限公司)、通用RT-PCR试剂盒(北京索来宝科技有限公司)，CD34免疫组化抗体、VEGF免疫组化抗体、PDGF免疫组化抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠心肌梗死模型建立 健康Wistar大鼠适应性喂养1周后，将大鼠用1%戊巴比妥钠40 mg/kg右下腹麻醉后备皮，碘酒常规消毒，背位固定，经切开喉管进行气管插管术，连接呼吸机，以75次/min、潮气量0.7～0.8 mL行人工呼吸。在大鼠左胸口周围缝合成布袋口袋，在左胸第3与第4肋骨用剪刀横切胸口，镊子钝性分离，于切口处打开胸腔，两手向下挤压、弹压胸腔，使心脏充分暴露在胸腔外部，剪开心包膜，在肺动脉圆锥与左心耳交界处的微下1～2 mm处用无创性缝线(5/0号线)结扎冠状动脉左前降支，等心脏搏动稍减弱，电脑显示Ⅱ导联心电图开始变化，心电图ST段出现明显上抬，最后抬高到弓背向上为造模成功。然后在创口周围喷洒少许青霉素粉剂，缝合胸壁。假手术组开胸后只过线不结扎。术后给予每只大鼠腹腔内注射青霉素150万u/(kg·d)，注射5 d，以预防感染，并在30℃条件下等大鼠自然苏醒［2］。

2.2 给药与分组 Wistar大鼠随机分为5组，冠心舒通胶囊高、低剂量组(A、B)，阳性药物对照组(贝复济与肝素对照组C)，模型对照组(D)及假手术组(E)。每组15只，中药组A、B 2组在心梗造模成功后，按高、低剂量给予大鼠灌胃1次/d。大鼠灌胃剂量∶低剂量组为成人每千克体质量的5倍，每只大鼠灌0.2 g/kg生药/d;高剂量组为成人每千克体质量剂量的10倍，每只大鼠灌0.4 g/kg生药/d，共4周;C组开胸结扎冠脉后马上在结扎处周围予贝复济(bFGF)喷洒，术后始皮下注射肝素120 iU/(kg·d)，共6 d;D组于术后第2天开始每天用生理盐水2 mL/(kg·d)灌胃1次，共4周;E组不进行任何药物干预，常规饲料喂养4周。连续给药4周后处死大鼠，取梗死边缘区心肌组织，进行免疫组化检测。

2.3 CD34免疫组织化学染色 免疫组化采用SP法，DAB显色，其中CD34抗体浓度1∶200。染色后血管内皮细胞成黄、棕色。微血管判断标准:按参照文献［3］以CD34的表达来标记血管内皮，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数。以生物医学图像分析计数大鼠心肌梗死边缘区新生血管数(MVC)，测定其阳性染色面积(MVD)，每张切片随机选取5个视野，分别测定其MVC、MVD，取平均值作为本只大鼠的MVC、MVD 值。

2.4 心梗大鼠梗死边缘区VEGF、PDGF-B蛋白的表达 按免疫组化法说明操作切片，将VEGF、PDGF-B抗体染色后的心肌组织切片采用图像分析软件采集数据，每组5张切片，每张切片随机选择2个视野，计算阳性表达数。

3 结果

3.1 冠心舒通胶囊对CD34阳性微血管数(MVC)及微血管面积(MVD)的影响 见表1。

表1 冠心舒通胶囊对CD34阳性表达及血管密度的影响(±s，n=15)

表1 冠心舒通胶囊对CD34阳性表达及血管密度的影响(±s，n=15)

注:与模型组比较:#P ＜0.05，与假手术组比较，△P ＜0.05，与低剂量组比较，▲△P＜0.05

MVC MVD假手术组 8.41 ±1.21 0.006 1 ±0.001 2组 别模型组 11.30 ±1.21△ 0.021 0 ±0.002 1阳性对照组 16.67 ±1.31#△▲ 0.040 5 ±0.003 1#△▲冠心舒通低剂量组 13.89±1.62#△ 0.027 2±0.002 8#△冠心舒通高剂量组 17.51 ±1.01#△▲ 0.041 5 ±0.002 9#△▲

3.2 对大鼠心肌梗死边缘区VEGP、PDGF-B蛋白表达量的影响 见表2。

表2 对大鼠心肌梗死边缘区VEGF、PDGF-B蛋白表达量的影响(±s，n=15)μm2

表2 对大鼠心肌梗死边缘区VEGF、PDGF-B蛋白表达量的影响(±s，n=15)μm2

注:与模型组比较，#P ＜0.05;与假手术组比较，△P ＜0.05;与低剂量组比较，▲P ＜0.05

蛋白组 别 VEGF蛋白 PDGF-B假手术组 17 628.08 ±2 256.00 10 368.08 ±3 451.50模型组 20 089.07 ±3 854.65△ 17 931.07 ±2 691.91△阳性对照组 32 079.32 ±2 549.21#△▲25 132.84 ±3 189.11#△▲冠心舒通低剂量组 27 456.28 ±2 046.91#△ 20 942.91 ±2 099.19#△冠心舒通高剂量组 32 312.31 ±2 218.45#△▲26 789.61 ±2 568.23#△▲

3.3 CD34免疫组织化学染色结果 1)CD34因子表达量各组与B组相比明显增多，与A组对比，C组、E组增多明显;2)PDGF蛋白表达量与B组相比明显增多，与A组对比，C组、E组表达量增多明显，D组增多不明显;3)VEGF蛋白表达量与A组对比，C组、E组表达量增多明显。

4 小结

VEGF是目前为止世界上公认的最重要的促血管生成及生长因子，又称血管通透性因子，具有改变细胞外基质，增加血管通透性，促进内皮细胞增生的生物学功能。VEGF选择性作用于内皮细胞的特性，有特异的靶向性，和其他促血管生成因子比较，具有专一性。VEGF分泌的主要因素是缺血导致局部组织缺氧，VEGF是特异的血管内皮细胞促分裂物，以内皮细胞为特异性靶细胞，具有较强的促内皮细胞有丝分裂和血管新生的作用［4］。Wojakowski等［5］研究发现，急性心肌梗死患者体内血浆VEGF因子表达量明显高于稳定型心绞痛患者。血小板衍化生长因子(PDGF)是一种重要的促细胞分裂剂，存在于血小板及上皮细胞和成纤维细胞。基因家族中包括PDGFA、B、C、D，其中PDGF-B与血管新生作用最为密切。PDGF-B蛋白不仅可以直接促毛细血管增生，且能通过诱导VEGFmRNA的表达，从而促进血管内皮细胞的增殖，加速局部血液循环的重建［6］。PDGF受体当中含有N-乙酸氨基葡萄糖和半乳糖残基，这些都具有蛋白酶的性质。PDGF亚基与细胞膜内的相应受体相互结合后发挥生物学效应:促进细胞增殖、进行组织修复及血管新生等［7］。

CD34是一种比较特异的血管内皮标记物，已被广泛应用。因此本试验采取CD34免疫组织化学染色统计阳性微血管数(MVC)及微血管面积(MVD)。研究［8-10］证实骨髓干细胞在特定环境中能被诱导分化为心肌细胞和血管内皮细胞，从而修复损伤坏死心肌，形成新生血管，改善心功能。本实验证明，冠心舒通胶囊可以促进大鼠心肌梗死边缘区CD34的蛋白表达，高低剂量组对VEGF、PDGF蛋白表达量有增生作用，效果优于低剂量组，但与阳性药物对照组相比无统计学意义。说明高剂量对血管新生作用有明显的促进作用。

［1］孙志坚.冠心舒通胶囊治疗冠心病心绞痛临床疗效观察［J］.内蒙古民族大学学报:自然科学版，2008(4):422-424.

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