补骨脂素固体脂质纳米粒的制备及其理化性质考察

宁 杰， 张荣华， 杨 丽， 周甜甜， 邵长丽， 蔡 宇*， 蔡天革

（1.暨南大学药学院，广东广州510632；2.辽宁大学生命科学学院，辽宁沈阳110036）

补骨脂素固体脂质纳米粒的制备及其理化性质考察

宁 杰1， 张荣华1， 杨 丽1， 周甜甜1， 邵长丽1， 蔡 宇1*， 蔡天革2*

（1.暨南大学药学院，广东广州510632；2.辽宁大学生命科学学院，辽宁沈阳110036）

目的制备补骨脂素固体脂质纳米粒（PSO-SLN）并对其理化性质进行考察。方法Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4μm），流动相为乙腈-水 （55：45），检测波长245 nm，体积流量1.0 mL/min，进样量20μL。采用高温乳化-低温固化法制备PSO-SLN，利用激光粒度分析仪对粒径、Zeta电位进行考察，透射电子显微镜观察形态，超滤法测定包封率。结果补骨脂素在0.5～16μg/mL质量浓度范围内线性关系良好 （r2=0.999 8）。日内、日间精密度试验的RSD均小于2%，平均回收率98.87%。所制备的PSO-SLN结构圆整，平均粒径（108.7±0.47）nm，Zeta电位（-18.8±0.27）mv。超滤管平均回收率为102.5%，平均包封率为（82.6±0.1）%。结论高温乳化-低温固化法可用于对PSO-SLN的制备。

补骨脂素；固体脂质纳米粒；高温乳化-低温固化法；包封率；超滤法

补骨脂素（psoralen，PSO）是一种天然香豆素类化合物，具有抗肿瘤、雌激素样以及多药耐药等多种药理活性［1-3］。补骨脂素水溶性较差［4］，直接口服生物利用度低，将水难溶性药物用固体脂质纳米粒进行包裹可以提高生物利用度［5-6］。固体脂质纳米粒 （SLN）是一种新型的给药系统［7-8］，它以生物相容性好的脂质材料作为载体，将药物包裹于脂质中可以有效防止药物的泄露，提高被包裹药物的稳定性。本研究采用高温乳化-低温固化法制备补骨脂素固体脂质纳米粒 （PSO-SLN）并对其理化性质进行考察。

1 仪器与材料

Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；UV-2550紫外可见分光光度计 （岛津公司）；CP124C万分之一分析电子天平（美国奥豪斯）；TECNAI10透射电子显微镜（荷兰飞利浦公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南巩义予华仪器有限公司）；激光粒度分析仪 （Zetasizer Nano ZS90，英国Malvern公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；30KD超滤离心管（Millipore）。

补骨脂素对照品 （批号110739-200613，纯度99%，广州市药品检验所）；补骨脂素原料药 （批号 BGZS20140216，纯度98%，南京春秋生物工程有限公司）；单硬脂酸甘油酯 （天津市博迪化工有限公司）；注射级大豆卵磷脂（上海太伟药业）；Labrasol辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（法国Gattefosse）；药用级吐温80（阿拉丁试剂有限公司）；水为纯净水；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 补骨脂素固体脂质纳米粒的制备 采用高温乳化-低温固化法制备PSO-SLN：称取2.5 mg补骨脂素、120 mg单硬脂酸甘油酯、180 mg大豆卵磷脂、30 mg Labrasol溶于适量无水乙醇中，置于75℃恒温水浴中加热溶解形成油相；同时将吐温80溶解于纯水中形成2.0%的吐温80水溶液作为水相。在75℃条件下，用注射器将油相缓缓注入水相中，在磁力搅拌器1 000 r/min的搅拌条件下搅拌乳化浓缩，当体积浓缩至约1/3体积时，将浓缩液倒入冰水中固化，过0.45μm滤膜即得PSO-SLN，同法可制备空白SLN。

2.2 包封率测定

2.2.1 固体脂质纳米粒包封率测定 采用超滤离心法取补骨脂素固体脂质纳米粒溶液0.5 mL，用甲醇溶解，HPLC法测定药物总量 （w1），另取0.5 m L置于超滤管中，12 000 r/min离心20min，HPLC法测定超滤管外管中游离药物含量 （w2）：包封率=（w1-w2）/w1。

2.2.2 超滤管回收率试验 取适量补骨脂素与空白固体脂质纳米粒溶液配制成质量浓度分别为20、50、100μg/mL的样品，各取0.5 mL的上述样品置于超滤管中，12 000 r/m in离心20 min，HPLC法测定超滤管外管中补骨脂素的量，测定3次，所得回收率分别为 （103.2±0.39）%、（100.0±0.97）%、（104.4±0.53）%，平均回收率102.5%，说明超滤法可用于对补骨脂素-固体脂质纳米粒包封率的测定。

按照上述方法，对所制备的补骨脂素-固体脂质纳米粒进行包封率测定，连续测定3次，包封率分别为82.5%、82.6%、82.7%，包封率平均值为 （82.6±0.1）%。

2.3 补骨脂素测定方法

2.3.1 最大吸收波长的选择 以纯甲醇为空白，一定质量浓度的补骨脂素甲醇溶液按照紫外分光光度法在200～400 nm波长范围内扫描，补骨脂素在245 nm处有最大吸收。

2.3.2 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4μm）；流动相 乙腈-水 （55：45）；检测波长245 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温25℃；进样量20μL。

2.3.3 专属性考察 取空白固体脂质纳米粒与补骨脂素固体脂质纳米粒分别用甲醇溶解，上述溶液分别过0.45μm滤膜后按照 “2.3.2”项色谱条件分别进样20μL，高效液相色谱法测定，见图1。

2.3.4 补骨脂素标准曲线的制备 精密称取干燥至恒定质量的补骨脂素对照品5 mg，加甲醇超声溶解，制成50 μg/mL的标准溶液，分别取上述溶液适量，加甲醇稀释成质量浓度为0.5、1、2、4、8、16μg/mL一系列的标准溶液，按照 “2.3.2”项色谱条件分别进样20μL，以峰面积对补骨脂素质量浓度进行线性回归，得到的标准曲线y= 158.22x+15.881（r2=0.999 8）表明补骨脂素在0.5～16 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 取1、4、16μg/mL不同质量浓度的补骨脂素溶液，一日内平行测定5次，RSD分别为1.6%、0.45%、1.27%；连续测定 5 d，RSD分别为 1.7%、0.73%、0.78%，日内、日间精密度均小于2%，精密度良好。

2.3.6 加样回收率试验 取空白固体脂质纳米粒，加入补骨脂素溶液，甲醇定容，配制成质量浓度分别为1、4、16 μg/mL的溶液，过膜，按照 “2.3.2”项色谱条件分别进样20μL测定，计算回收率分别为100.3%、98.75%、97.56%，平均回收率98.87%。

2.3.7 稳定性试验 取质量浓度为4μg/mL的补骨脂素溶液，分别于2、4、6、8、12、24 h进样测定，计算RSD= 1.1% （n=6），稳定性良好。

图1 空白SLN、补骨脂素对照品溶液、补骨脂素SLN色谱图

2.4 Zeta电位与粒径测定 将补骨脂素-固体脂质纳米粒分散液稀释适当的倍数，用激光粒度分析仪测定Zeta电位与粒径，所得粒径（108.7±0.47）nm，PDI 0.224±0.015，Zeta电位（-18.8±0.27）mv，见图2。

图2 补骨脂素固体脂质纳米粒Zeta电位及粒径分布图

2.5 补骨脂素SLN形态观察 取补骨脂素-固体脂质纳米粒分散液，将其滴在有碳膜的铜网上，2%磷钨酸染色30 s，铜网晾干之后在透射电子显微镜下观察粒子的形态，补骨脂素-固体脂质纳米粒结构圆整，粒子平均粒径在100 nm左右，见图3。

3 讨论

图3 补骨脂素SLN透射电镜图

实验曾采用薄膜超声法与乳化超声法制备固体脂质纳米粒，超声法得到的固体脂质纳米粒粒度分散较大，有可见性颗粒存在，采用高温乳化-低温固化的方法制备固体脂质纳米粒，操作简单，制备的SLN粒度分散好，所以实验选用高温乳化-低温固化法。

实验室常用的固体脂质纳米粒的脂质材料有硬脂酸、单硬脂酸甘油酯以及山嵛酸甘油酯［9-10］，本实验采用硬脂酸稳定性极差，放置2 h以上会出现絮凝现象，山嵛酸甘油酯的熔点较高，制备过程需要较高的温度，并且脂质黏度较大，得到的固体脂质纳米粒粒径偏高。用单硬脂酸甘油酯作为载体所制得的固体脂质纳米粒粒径、包封率均较好，所以实验选用单硬脂酸甘油酯作为脂质载体。

包封率的常用测定方法有葡聚糖凝胶柱层析法、超高速离心法以及超滤法［11-12］，由于补骨脂素水溶性较差，在采用葡聚糖凝胶柱层析法测定补骨脂素-固体脂质纳米粒包封率的过程中游离药物较难洗脱，并且操作费时费力。单硬脂酸甘油酯的密度约为0.97 g/cm3，密度与水相近，采用高速离心的方法不能实现脂质载体与分散介质的有效分离。本研究选用超滤离心法测定补骨脂素-固体脂质纳米粒包封率，操作简单，结果准确，可用于对补骨脂素-固体脂质纳米粒包封率的测定。

［1］谭 敏，孙 静，赵 红，等.补骨脂素对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞体外作用的比较研究［J］.北京中医药大学学报，2009，6（4）：259-362.

［2］赵丕文，牛建昭，王继峰，等.补骨脂素的植物雌激素作用及其作用机制探讨［J］.中国中药杂志，2008，33（1）：59-63.

［3］陈 超，蔡天革，张荣华，等.6种中药活性成分对K562/ADM耐药性逆转及P27和P170蛋白表达影响［J］.中成药，2014，36（1）：1-4.

［4］郭 洁，宋殿荣.补骨脂香豆素成分研究进展［J］.天津中医药，2013，30（4）：250-253.

［5］胥 娜，钟文英，朱丹妮.固体脂质纳米粒在提高难溶性药物生物利用度中的应用［J］.中华中医药学刊，2007，25（8）：1605-1607.

［6］Esposito E，Fantin M，MartiM，et al.Solid lipid nanoparticles as delivery systems for bromocriptine［J］.Pharm Res，2008，25（7）：1521-1530.

［7］薛 梅，李学军，刘素嬛，等.固体脂质纳米粒在中药研究中的进展［J］.南京中医药大学学报，2012，28（6）：597-600.

［8］Yoon C，Park JW，Yoon IS.Solid lipid nanoparticles（SLNs）and nanostructured lipid carriers（NLCs）：recent advances in drug delivery［J］.JPharm Invest，2013，43（5）：353-362.

［9］盛欢欢，杨 涛，李 岩，等.HPLC法测定穿心莲总内酯固体脂质纳米粒载药量与包封率［J］.中成药，2012，34（3）：458-462.

［10］张 卿，张良珂，袁 佩，等.和厚朴酚固体脂质纳米粒的制备及性质研究［J］.中草药，2011，42（4）：691-693.

［11］赵 锋，栾瀚森，罗华菲，等.葡聚糖凝胶色谱法用于纳米粒包封率的测定［J］.中国药学杂志，2012，47（17）：1385-1390.

［12］李 园，陈桐楷，林华庆，等.石杉碱甲固体脂质纳米粒包封率的测定方法研究［J］.广东药学院学报，2010，26（2）：111-114.

R944

B

1001-1528（2015）04-0887-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.045

2014-07-21

国家自然科学基金 （81273707）；教育部新世纪优秀人才支持计划 （NECT-12-0677）；广东省自然科学基金（S2013010012880）；广东省教育厅科研项目 （2013KJCX0021）；广州市对外科技合作平台项目 （2014J4500005）

宁 杰（1989—），男，硕士生，从事中药制剂学研究。Tel：18924254326，E-mail：xinxinxiaojie@163.com

*通信作者：蔡 宇 （1972—），男，博士，教授。Tel：15625156405。蔡天革，满族，教授，从事中药逆转肿瘤多药耐药机制研究。Tel：15322249305，E-mail：caitiange@163.com