姜黄素对肺纤维化大鼠骨髓及外周血内皮祖细胞的影响

肖 梦， 江 涛*， 孙秋艳， 陈 聂， 冯燕梅

（1.重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016；2.邯郸市第四医院急诊科，河北 邯郸056200）

姜黄素对肺纤维化大鼠骨髓及外周血内皮祖细胞的影响

肖 梦1， 江 涛1*， 孙秋艳2， 陈 聂1， 冯燕梅1

（1.重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016；2.邯郸市第四医院急诊科，河北 邯郸056200）

目的探讨姜黄素对肺纤维化大鼠骨髓及外周血中内皮祖细胞 （EPCs）数量、内皮型一氧化氮合酶 （eNOS）表达的影响及其机制。方法采用经气管灌注博莱霉素 （BLM）的方法制作肺纤维化模型。60只大鼠完全随机分为对照组、模型组、姜黄素组。每组于第14天、28天各处死10只大鼠。肺组织行HE染色观察并进行肺纤维化Ashcroft评级，采用流式细胞术检测骨髓及外周血中EPCs的数量，Western blot法检测骨髓中eNOS蛋白的表达。结果姜黄素组肺泡炎和肺纤维化程度明显低于模型组。与对照组比较，模型组各时间点骨髓及外周血EPCs数量及eNOS蛋白的表达明显降低 （P＜0.01）。与模型组比较，姜黄素组各时间点骨髓及外周血EPCs数量及eNOS蛋白的表达亦明显增多（P＜0.05）。结论姜黄素可上调肺纤维化大鼠骨髓及外周血EPCs数量，促进EPCs动员入血，其作用可能与姜黄素激活eNOS通路相关。

姜黄素；大鼠；肺纤维化；骨髓；外周血；内皮祖细胞 （EPCs）；内皮型一氧化氮合酶 （eNOS）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种慢性炎症性疾病，发病机制尚不清楚，现有治疗方法疗效差，病死率高［1］。因此，深入地探讨肺纤维化的发病机制，进而寻找治疗肺纤维化的有效手段是目前研究的热点。近几年来肺血管的功能受损在肺纤维化中的作用日益受到学者们的重视［2］，已证实肺血管内皮细胞的损伤存在于整个肺纤维化发病阶段，电镜下可观察到血管内膜的增厚和断裂［3-4］。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作为一类具有增殖能力的干细胞，主要存在于机体的骨髓中，在某些病理生理环境下，可以从骨髓动员至外周血中，参与血管的再生与修复［5］。而内皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）可调控一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成，同时激活基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases 9，MMP-9），促进内源性EPC的动员［6-7］。本研究通过观察在姜黄素的干预作用下肺纤维化大鼠骨髓及外周血EPCs数量及eNOS蛋白表达的变化情况，初步探讨姜黄素促进EPCs动员及减轻肺纤维化的机制，为临床上预防和治疗肺纤维化提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器与动物分组 姜黄素 （购自四川金郁金公司，批号050302，纯度95.6%）。博莱霉素注射液 （日本化药株式会社生产，批号740140）。硫氰酸荧光素 （FITC）标记小鼠抗大鼠CD34抗体、羊抗鼠eNOS抗体及β-actin抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。红细胞裂解液，Western相关试剂购自碧云天生物技术研究所。FACSVantage SE流式细胞仪购自美国BD公司。Western相关设备购自美国BIO-RAD公司。

清洁级成年雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，由重庆医科大学实验动物中心提供动物使用许可证号为SYXK（渝）2007-0001。并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。大鼠完全随机分为对照组、模型组和姜黄素组。根据肺纤维化造模后观察时间点，各组分为14 d、28 d 2个亚组。

1.2 动物模型制备 用3.5%的水合氯醛（1 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口，钝性分离，逐层暴露气管，注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管。模型组和姜黄素组大鼠缓慢注入博莱霉素生理盐水溶液（5 mg/kg）0.3 m L，对照组大鼠注入相同体积的生理盐水，注后立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布，缝合皮肤，继续喂养。

1.3 给药方法 大鼠造模第2天后，给予各组大鼠灌胃处理。对照组和模型组大鼠每日给予0.5%羧甲基纤维素钠溶剂，给药容量为0.014 L/kg。姜黄素大鼠每日给予200 mg/kg姜黄素羧甲基纤维素钠溶液 （姜黄素在使用时将其溶于0.5%羧甲基纤维素钠配成混悬液中）［8］。

1.4 取材方法 于造模后第14天及28天进行2次取材，每次取材各组随机处死10只大鼠。用3.5%的水合氯醛 （1 m L/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，将其固定，2 mL真空抗凝管腹主动脉取血，混匀后作为流式细胞学检测备用；夹闭腹主动脉，剪下大鼠双侧后肢，一部分用预冷的PBS冲洗出骨髓腔中的骨髓细胞，吹打均匀，用70μm的细胞筛过滤，调整细胞数在106～107次方左右作为流式细胞学检测备用；另一部分直接取新鲜的骨髓，RIPA裂解液提取总蛋白，-80℃保存作为Western blot备用。打开胸腔，多聚甲醛灌注固定取肺叶。

1.5 肺组织病理学分析 取病变处肺叶，4%多聚甲醛固定24 h，经梯度乙醇脱水后行石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，封片后在光镜下观察肺组织病理改变，按照Ashcroft等［9］的方法进行肺纤维化严重度的形态学半定量分析。0级为正常肺组织；1级为肺泡或细支气管壁轻微纤维性增厚；2级为介于1级与3级之间；3级为中度肺泡或细支气管壁纤维性增厚，无明显肺组织结构破坏；4级为介于3级和5级之间；5级为纤维化增强伴有明确的组织结构破坏，纤维束或纤维团块形成；6级为介于5级与7级之间；7级为肺组织结构严重破坏，大的纤维化区域形成，可伴蜂窝肺形成；8级为整个肺组织区域纤维性闭塞。

1.6 流式细胞术检测外周血及骨髓EPCs数量

取外周血及骨髓细胞悬液各100μL，加入20μL小鼠抗大鼠FITC-CD34抗体孵育25 min后，加入红细胞裂解液2 mL避光孵育5 min，4℃下1 500 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次后，100μL PBS重悬细胞。4 h内流式细胞仪上机检测CD34+EPCs数量 （占单核细胞数量的百分比）。

1.7 Western blot方法检测骨髓中eNOS蛋白的表达情况 取新鲜骨髓，RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度。加入蛋白标本进行SDS-PAGE（分离胶10%）凝胶电泳后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入eNOS抗体（1：1 000），B-actin（1：1 000）抗体4℃孵育过夜后复温2 h，TBST洗膜后放入二抗中孵育2 h，TBST洗膜后ECL显色，凝胶成像仪显像，采用Quantity One软件进行灰度值分析，用eNOS的灰度值与B-actin的灰度值的比值表示eNOS蛋白相对表达水平。

1.8 统计学处理 实验数据采用统计软件SPSS 17.0进行处理，数据以均数±标准差 （）表示，采用方差分析和LSD检验。检验水准α= 0.05，P＜0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察 光镜下观察见图1，对照组肺组织结构正常，模型组第14天时肺间质及肺泡内有大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增宽；第28天时，大量肺泡腔塌陷、消失，由胶原和纤维蛋白占据。姜黄素组第14天炎症细胞渗出较模型组轻，肺泡间隔轻度增厚；第28天，肺组织结构较模型组完整，少量肺泡萎陷，肺泡间隔明显增宽。根据Ashcroft评分标准模型组肺纤维化程度在不同时间点均明显高于对照组 （P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素组肺组织肺纤维化程度均有不同程度的改善，见表1。

图1 大鼠肺组织病理学变化 （HE×100）Fig.1 Pathologic changes of the rat lung tissue（HE×100）

表1 肺纤维化Ashcroft评分（，n=10）Tab.1 Ashcroft score of pulmonary fibrosis（，n=10）

表1 肺纤维化Ashcroft评分（，n=10）Tab.1 Ashcroft score of pulmonary fibrosis（，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别 第14天 第28天0.52±0.21 0.53±0.26模型组 3.75±0.35* 5.27±0.51*姜黄素组 2.46±0.31△ 4.01±0.40对照组△

2.2 大鼠骨髓EPCs数量变化 流式细胞术结果显示，大鼠肺纤维化造模后第14天、28天骨髓EPCs数量明显低于对照组 （P＜0.01）；姜黄素组在第14天时EPCs数量高于模型组 （P＜0.05），在第28天时显著高于模型组 （P＜0.01）。见图2。

2.3 大鼠外周血EPCs数量变化 流式细胞术结果显示，大鼠肺纤维化造模后第14天、第28天外周血EPCs数量明显低于对照组（P＜0.01）；姜黄素组在第14天时EPCs数量高于模型组（P＜0.05），在第28天时显著高于模型组 （P＜0.01）。见图3。

图2 流式细胞术显示各组骨髓EPCs数量的变化（，n=10）Fig.2 Quantitative evaluation of EPCs in bonemarrow by flow cytometry in each group（，n=10）

图3 流式细胞术显示各组外周血EPCs数量的变化（，n=10）Fig.3 Quantitative evaluation of EPCs in peripheral blood by flow cytometry in each group（，n=10）

2.4 姜黄素可上调肺纤维化大鼠eNOS蛋白的表达 结果显示模型组中eNOS蛋白的表达在肺纤维化造模后第14天及28天均明显低于对照组 （P＜0.01）。而姜黄素组在第14天及28天eNOS表达明显高于模型组 （P＜0.01），见图4。

3 讨论

图4 W estern-blot显示各组eNOS蛋白的表达变化（，n=10）Fig.4 Exp ression of eNOS protein by W estern-blot in each group（，n=10）

肺纤维化作为一种慢性进展性疾病，其主要的病理特点是弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱。然而慢性炎症除了累及肺泡外，还会渐渐蔓延到肺间质乃至肺血管。肺血管内皮细胞的不断损伤会引起血管通透性增加，加速肺纤维化病情恶化的进程。EPCs作为内皮细胞的前体细胞，可直接分化为血管内皮细胞，参与修复损伤的血管内皮功能［10］。EPCs的表面标记物主要有VEGFR2、CD34、CD31、CD133等，其中CD34+EPCs虽然不能准确代表EPCs，但研究表明其具有较强的血管修复能力［11］。故本研究采用CD34标记骨髓及外周血的EPCs。但在长期炎症、低氧、氧化应激等环境条件下，EPCs分化受阻且EPCs的动员也受到抑制，导致肺血管内皮细胞功能紊乱及肺血管的损伤。NO是一种内源性的血管舒张因子，分泌过程受到限速酶eNOS的调控，一方面能激活MMP-9，促进内皮祖细胞的动员［12］；另一方面NO可抑制血管平滑肌的增殖，使受损的血管恢复弹性，修复内皮细胞的功能［13］。在肺纤维化发病过程中eNOS活性下降，NO合成减少，EPCs的动员与分化减少，使血管内皮功能紊乱，此结果与Malli等人［14-15］的报道结果相似。因此，增强eNOS蛋白的表达，促进骨髓EPCs的分化与动员，可能成为肺纤维化治疗的新思路。

姜黄素是从姜科植物姜黄的地下根茎中分离出的主要活性物质，具有抗炎、抗氧化、降脂、抗肿瘤等广泛的作用。同时姜黄素具有药物浓度安全范围大，毒副作用小，价格低廉等特点，为该药走向临床提供了很好的先决条件［16］。以往的研究发现姜黄素有保护并改善血管内皮功能的作用［17］。然而姜黄素是否对肺纤维化的血管内皮细胞也起同样的保护作用，目前尚无相关研究。本实验以肺纤维化大鼠为研究对象，在姜黄素干预下肺组织纤维化情况明显减轻，eNOS的表达上调，骨髓和血中EPCs数量降低情况也明显好转。由此可见，姜黄素可促进肺纤维化大鼠骨髓CD34+EPCs的动员，增加骨髓及外周血CD34+EPCs数量，减轻肺泡炎和肺纤维化程度，且这一作用可能与激活eNOS通路相关。

本研究明确了姜黄素在肺纤维化大鼠模型中抗纤维化作用。进一步充实了姜黄素的作用机理，为姜黄素治疗肺纤维化及提供了初步的理论依据。鉴于姜黄素对肺纤维化骨髓EPCs的动员及肺血管修复作用机制颇为复杂，涉及多种信号分子通路，其更为完善的机制尚待进一步研究。

［1］Willems S，Verleden SE，Vanaudenaerde BM，etal.Multip lex protein profiling of bronchoalveolar lavage in idiopathic pulmonary fibrosis and hypersensitivity pneumonitis［J］.Ann Thorac Med，2013，8（1）：38-45.

［2］Strieter R M，Mehrad B.New mechanisms of pulmonary fibrosis［J］.Chest，2009，136（5）：1364-1370.

［3］颜林枫，南海燕，崔光彬，等.肺微血管内皮细胞表型改变与博莱霉素所致大鼠肺纤维化的关系［J］.第四军医大学学报，2008，29（16）：1485-1461.

［4］崔光彬，魏经国，王 玮，等.博莱霉素对大鼠肺微血管内皮细胞紧密连接改变及Cx43表达变化的影响［J］.中华劳动卫生职业病杂志，2006，24（2）：99-102.

［5］Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bonemarrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiologicaland pathological neovasc-ularization［J］.Circ Res，1999，85（3）：221-228.

［6］Cui X，Chopp M，Zacharek A，et al.Role of endothelial nitric oxide synthetase in arteriogenesis after stroke in mice［J］. Neuroscience，2009，159（2）：744-750.

［7］Heissig B，Hattori K，Dias S，et al.Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP-9 mediated release of Kit-ligand［J］.Cell，2002，109（5）：625-637.

［8］李银生，刘建昭，王继峰，等.姜黄素抗博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的实验研究［J］.中华中医药学刊，2007，25（4）：698-700.

［9］Ashcroft T，Simpson JM，Timbrell V.Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on anumerical scale［J］.J Clin Pathol，1988，41（4）：467-470.

［10］范思均，何守志.血管内皮生长因子A的选择性剪接与眼内新生血管的生成［J］.中华眼科杂志，2011，47（4）：373-377.

［11］Asahara T，Kawamoto A，Masuda H，et al.Concise review：Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine［J］.Stem Cells，2011，29（11）：1650-1655.

［12］Yoshimura S，Nishimura Y，Nishiuma T，et al.Overexpression of nitric oxide synthase by the endothelium attenuates bleo-mycin-induced lung fibrosis and impairs MMP-9/TIMP-1 balance［J］.Respirology，2006，11（5）：546-556.

［13］Aicher A，Heeschen C，Mildner-Rihm C，et al.Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells［J］.Net Med，2003，9（11）：1370-1376.

［14］Malli F，Koutsokera A，Paraskeva E，et al.Endothelial progenitor cells in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis：an evolving concept［J］.PLoSONE，2013，8（1）：1-8.

［15］Smadja D M，Mauge L，Nunes H，et al.Imbalance of circulating endothelial cells and progenitors in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Angiogenesis，2013，16（1）：147-157.

［16］Tanwar V，Sachdeva J，Golechha M，etal.Curcumin protects rat myocardium against isoproterenol-induced ischemic injury：attenuation of ventricular dysfunction through increased expression of Hsp27 along with strengthening antioxidant defense system［J］.JCardiovasc Pharmacol，2010，55（4）：377-384.

［17］杨 阳，段维勋，金振晓，等.姜黄素对血管内皮细胞过氧化氢损伤的保护作用及其机制研究［J］.中国体外循环杂志，2011，9（4）：239-242.

Effect of curcum in on endothelial progenitor cells on bonemarrow and peripheral blood in rats with pulmonary fibrosis

XIAO Meng1， JIANG Tao1*， SUN Qiu-yan2， CHENG Nie1， FENG Yan-mei1

（1.Department of Respiratory Diseases，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Department of Emergency，The Forth Hospital of Handan，Handan 056200，China）

AIMTo study the effect of curcumin on the number of endothelial progenitor cells，（EPCs）the protein expression of eNOS in bone marrow and peripheral blood in rats with pulmonary fibrosis and explore their possible mechanism.METHODSPulmonary fibrosismodel of SD ratswas reproduced by the single intratracheal perfusion of bleomycin.Sixty rats were randomly divided into the control group，model group，and curcumin group.Ten ratswere sacrificed from each group on the 14thand 28thday.The lung tissue was observed by HE staining and evaluated for the formation of lung fibrosis by using Ashcroft scoring system.Flow cytometer was used to determine the percentage of EPCs in bonemarrow and peripheral blood.The protein expression of eNOSwas detected by Western-blot.RESULTSThe alveolitis and the pulmonary fibrosis in the curcumin group were significantly alleviated.In comparison with the control group，the percentage of EPCs in bone marrow and peripheral blood and the protein expression of eNOSwere significantly reduced in themodel group（P＜0.01）.In comparison with themodel group，the percentage of EPCs in bonemarrow and peripheral blood and the protein expression of eNOS were significantly up-regulated in curcumin group（P＜0.05）.CONCLUSIONSCurcumin can effectively upregulate the percentage of EPCs in bone marrow and peripheral blood，and help bone marrow EPCsmigrate into peripheral blood through activating eNOS pathway in rats with pulmonary fibrosis.

curcumin；rat；pulmonary fibrosis；bonemarrow；peripheral blood；endothelial progenitor cells（EPCs）；eNOS

R285.5

A

1001-1528（2015）04-0700-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.003

2014-08-15

重庆市科委应用开发重大基金（cstc2014yyKfA110026）

肖 梦（1989—），女，硕士生。Tel：18716296820，E-mail：409488586@qq.com

*通信作者：江 涛，女，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向为慢性肺部疾病的研究。E-mail：j.tcq@163.com