闪式提取法用于大蝎子草总黄酮的工艺条件研究

2015-01-16李桂兰贺智勇薛雨晨吴林菁沈祥春

中成药 2015年7期

关键词：量瓶蒸馏水贵阳

李桂兰，贺智勇，薛雨晨，吴林菁，陶玲*，沈祥春*

（1.贵阳医学院中药药剂教研室，贵州贵阳550004；2.贵阳医学院天然药物优效利用重点实验室，贵州贵阳550004）

闪式提取法用于大蝎子草总黄酮的工艺条件研究

李桂兰1，2，贺智勇1，2，薛雨晨1，2，吴林菁1，2，陶玲1，2*，沈祥春1，2*

（1.贵阳医学院中药药剂教研室，贵州贵阳550004；2.贵阳医学院天然药物优效利用重点实验室，贵州贵阳550004）

目的探索有效的大蝎子草总黄酮提取方法。方法比较回流提取、闪式提取两种方法，及水和乙醇分别作为溶剂提取大蝎子草总黄酮的效果，并采用正交试验设计，对闪式提取大蝎子草总黄酮工艺条件进行优化。结果闪式提取大蝎子草总黄酮最佳工艺为蒸馏水温度60℃，料液比1∶75，提取时间为4 min，闪提转速4 000 r/min，提取率为9.093 mg/g，优于乙醇为溶剂的回流提取法。结论闪式提取法操作简便、高效经济，与回流提取法相比，采用闪式提取法并用热水作溶剂提取大蝎子草总黄酮取得较好效果。

大蝎子草；总黄酮；闪式提取；正交试验

大蝎子草Girardinia diversifolia（Link）Friis.的全草或根作为贵州苗族民间用药历史悠久，在《贵州中草药名药》《滇药录》《藏本草》《四川常用草药》等均有记载，味苦、辛，性凉，有小毒，主要用于治疗中风不语、咳嗽多痰、风湿疼痛、跌打损伤、骨折等［1-2］。荨麻属植物生态学和药效学及临床等方面研究较多，但大蝎子草的提取工艺研究尚未见报道［3-6］。

闪式提取法是近年发展起来的一种用于中草药提取的高新技术，该设备以组织破碎原理为基础，具有快速、高效、充分、完全提取、操作简便的特点，而且节省能源，有效保护了提取物质中的热敏性成分，与传统提取方法相比具有非常显著的优势。

本研究以大蝎子草中抗炎有效成分总黄酮含有量为指标，进行不同提取方法和不同溶剂对大蝎子草总黄酮提取率影响的考察，探讨并采用正交试验设计对闪式提取工艺条件进行研究，为大蝎子草中有效成分的提取提供简便、快捷的方法。

1 仪器与试药

JHBE-50S闪式提取控制器（北京金鼎科技发展有限公司）；UV2401PC紫外可见分光光度计（岛津）；FA20304电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司），托盘天平（上海光正医疗器械有限公司）；

芹菜素对照品（中国食品药品检定研究院，纯度大于98%）；乙醇为分析纯。大蝎子草药材采集于贵州省贵阳市花溪区，经贵阳医学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定为荨麻科蝎子草属植物大蝎子草Girardinia diversifolia（Link）Friis.的地上部分。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的配制精密称取芹菜素对照品5 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，即得0.20 mg/mL的芹菜素对照品贮备液。

2.1.2 最大吸收波长的确定以乙醇为空白对照，采用紫外可见分光光度计，分别在波长为190～400 nm区间扫描芹菜素对照品和大蝎子草供试样，结果表明，二者均在在268 nm波长附近有最大吸收，故选择最大吸收波长为268 nm［7］。

2.1.3 标准曲线的绘制精密移取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别置于50 mL量瓶中，乙醇定容，得到质量浓度分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0μg/mL的对照品供试液。采用紫外可见分光光度计在268 nm波长下测定吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制备标准曲线，得到回归方程Y= 0.035 5X+0.001 1，相关系数r=0.999 7。结果表明芹菜素在2.0～12.0μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验精密移取对照品溶液1 mL于25 mL的量瓶中，乙醇定容，紫外可见分光光度计在268 nm处测定吸光度，重复测定6次，计算得RSD为0.23%，表明精密度良好。

2.1.5 稳定性试验精密移取供试品溶液1 mL于25 mL的量瓶中，乙醇定容，摇匀，分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、24 h于268 nm波长处用紫外可见分光光度计测定吸光度，并计算其前8 h的RSD为8.6%，前6 h的RSD为2.2%，说明样品在6 h内稳定。

2.1.6 重复性试验精密移取6份1 mL供试溶液置于25 mL量瓶中，分别用紫外可见分光光度计测定吸光度值，计算得到RSD为1.4%，说明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验精密移取6份1 mL供试溶液置于25 mL量瓶中，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.200 mg/mL上述对照品溶液，分别相当于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg，定容，摇匀，在268 nm波长处测定吸光度，计算得平均回收率为99.2%，RSD为0.57%。

2.1.8 大蝎子草中总黄酮的定量测定取大蝎子草提取液适量，过滤，3 000 r/min离心10min，精密移取上清液5mL，备用；分别采用石油醚洗脱、乙酸乙酯萃取等多种样品处理方法进行考察，最后采用精密移取离心后的大蝎子草提取液5 mL，置于蒸发皿中，挥干，60%乙醇洗至25 mL量瓶中，定容；再精密移取1 mL置25 mL量瓶中，95%乙醇定容，于波长268 nm处测定吸光度值并计算总黄酮的含有量。

2.2 大蝎子草总黄酮闪式提取［8-9］

2.2.1 因素水平选取蒸馏水温度（℃），料液比（m/V），提取时间（min）为考察因素，见表1。

表1 闪式提取工艺因素水平

2.2.2 实验方法分别称取大蝎子草细粉9份，每份20 g，闪提转速4 000 r/min，电压200 V，按L9（34）正交试验表进行试验设计，见表2，测定提取液中总黄酮含有量，考察最佳提取工艺条件。

表2 闪式提取工艺正交试验安排及结果

2.2.3 方差分析运用SPSS软件对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 正交试验结果方差分析

由表3可知，A、B因素对闪式提取大蝎子草总黄酮含有量的影响具有统计学意义，结合直观分析，各因素影响大小顺序为：B＞A＞C，即料液比＞蒸馏水温度＞提取时间，最佳工艺条件是A2B3C2，即蒸馏水温度60℃，料液比为1∶75，提取时间为4 min。

2.2.4 最佳提取工艺验证试验称取大蝎子草细粉5份，每份20 g，按照最佳工艺进行提取，测定并计算总黄酮含有量，得到总黄酮平均含有量为9.093 mg/g生药，RSD为1.7%，见表4。

表4 最佳提取工艺的验证试验

3 讨论

闪式提取器外刀腔内高速旋转，内外刀之间不仅产生强大的剪切作用，同时外刀腔内产生强大的负压，药材被破碎而充分暴露的物质分子（被提取成分）在负压、剪切、高速碰撞等各种外力作用下被溶剂分子包围，解离，溶解，替代，脱离，然后迅速进入溶剂中，瞬间达到溶剂浓度的平衡，在数秒内快速完成提取过程［10］。

本次闪式提取研究中，首先根据黄酮的理化性质，设置50倍溶剂量，采用单因素试验进行50%、60%、70%乙醇提取大蝎子草总黄酮闪式提取考察，结果显示，总黄酮最大提取率仅为3.45mg/g，低于前期水为溶剂回流提取正交试验考察结果。结合前期总黄酮测定方法，采用较优的工艺条件，用水和乙醇为溶剂进行了回流提取的比较，结果显示，对于大蝎子草总黄酮的提取，水为溶剂比乙醇作为溶剂的效果好，所以闪式提取工艺考察中采用水为溶剂进行，同时还进行了蒸馏水不同温度的考察，结果表明，当蒸馏水温度为60℃时提取率比40℃和80℃好，40℃时优于80℃，原因可能是，黄酮类化合物一般都以苷的形式存在，苷易溶于热水，所以热水效果优于冷水；但由于80℃的温度过高，使药材细胞表面蛋白迅速固化成膜，外界的水不易进入细胞，细胞不能因渗透压差破裂，及细胞内物质扩散效率变低，总黄酮不能从细胞内高效提取出来。

本实验以总黄酮提取率为指标，以蒸馏水温度、料液比、提取时间作为正交试验的3个考察因素，并各设了3个水平对大蝎子草的闪式提取工艺进行了考察。由实验结果可知，闪式提取大蝎子草总黄酮的最大影响因素是料液比，其次是蒸馏水温度，最小影响因素是提取时间。结合直观分析，可以确定最佳实验条件是A2B3C2，即提取温度为60℃，料液比为1∶75，提取时间为4min，按该最佳提取工艺进行提取时，大蝎子草总黄酮为9.093 mg/g生药。

闪式提取法具有快速高效、省时、操作简便等优点，能最大限度保护植物的有效成分不受热破坏，提取率高，节约能源［11］。但由于大蝎子草药材质地疏松，回流提取至少都需要接近20倍的溶剂量，采用闪式提取所用溶剂量更是大为提高。

［1］李宁，张庆林.荨麻属植物化学成分和药理作用研究进展［J］.中国新药杂志，2007，16（21）：1746-1749.

［2］贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准：2003年版［S］.贵阳：贵州科技出版社，2003：187.

［3］陶玲，支娜，柏帅，等.大蝎子草抗炎镇痛活性部位研究［J］.时珍国医国药，2009，20（6）：1404-1405.

［4］沈祥春，支娜，许立，等.大蝎子草乙酸乙酯部位对脂多糖诱导巨噬细胞炎症介质表达的影响［J］.中华中医药杂志，2010，25（9）：1397-1400.

［5］支娜，陶玲，沈祥春.大蝎子草水层部位对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞iNOS与TNF-α的影响［J］.中药药理与临床，2010，26（3）：39-41.

［6］陶玲，高玉琼，沈祥春，等.大蝎子草根、茎、叶的挥发性成分GC-MS分析［J］.中国药学杂志，2009，44（21）：1931-1932.

［7］刘文炜，沈祥春，陶玲，等.紫外分光光度法测定大蝎子草药材中总黄酮的含量［J］.中国药房，2010，21（43）：4088-4089.

［8］谢仲德，李文烈，方应权，等.白芍中芍药苷的闪式提取工艺研究［J］.中成药，2013，35（9）：2037-2040.

［9］赵宏，张宇，王宇亮，等.银杏叶总黄酮提取工艺的正交设计法优化［J］.时珍国医国药，2013，24（8）：1852-1853.

［10］于敏，韩德强.闪式提取法提取丹参中有效成分的研究［J］.中成药，2010，32（9）：1609-1612.

［11］刘延泽.植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践［J］.中国天然药物，2007，5（6）：401-407.