中药天然成分抗非霍奇金淋巴瘤的协同机制实验研究进展

朱伟嵘， 沈小珩， 王 洁

（1.上海中医药大学，上海201203；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院中医科，上海200025）

[综述]

中药天然成分抗非霍奇金淋巴瘤的协同机制实验研究进展

朱伟嵘1， 沈小珩2*， 王 洁2

（1.上海中医药大学，上海201203；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院中医科，上海200025）

恶性淋巴瘤是一类原发于淋巴结或结外部位淋巴组织和器官的免疫细胞肿瘤。在我国，非霍奇金淋巴瘤（NHL）约占其中的90%。NHL是一组在细胞遗传学、免疫表型和临床特征方面均存在很大异质性的肿瘤。化疗是目前主要的治疗手段，近年虽然单克隆分子靶向药物的应用显著提高了总体疗效，但仍有部分患者耐药或复发。在我国中医药用于治疗恶性肿瘤性疾病有着悠久的历史。近年大量基础实验研究证实，许多中药天然成分具有抗淋巴瘤增殖活性和诱导凋亡等广泛的调节机制，与化疗药物联合治疗具有明显的协同作用。现就实验研究中发现的协同作用的机制进行归纳分析，为中医药更好地应用于临床淋巴瘤治疗提供理论依据。

非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤；中医药；化疗；协同机制

恶性淋巴瘤（malignant lymphoma，ML）是一类原发于淋巴结或结外部位淋巴组织和器官的免疫细胞肿瘤。在我国，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）约占恶性淋巴瘤中的90%，是一组在细胞遗传学、免疫表型和临床特征方面均存在很大异质性的肿瘤。化疗是目前主要的治疗手段，近年来虽然单克隆分子靶向药物的应用显著提高了总体疗效，但仍有部分患者耐药或复发。

在我国，中医药用于治疗恶性肿瘤性疾病有着悠久的历史。近年大量基础实验研究证实，许多中药天然成分具有抗淋巴瘤增殖活性和诱导其凋亡等广泛的调节机制，与化疗药物联合治疗具有明显的协同作用。现就实验研究中发现的协同作用机制进行归纳分析，为中医药更好地应用于临床淋巴瘤治疗提供理论依据。

1 中药天然成分与化疗联合的协同作用及机制

1.1 阻滞细胞周期及相关因子 三氧化二砷（As2O3，arsenic trioxide，ATO）是一种广泛应用的针对急性早幼粒细胞白血病 （APL）的药物，近年来研究发现，它有显著的抗淋巴瘤作用。Duan等［1］利用周塔拉雷分析（Chou-Talalay analysis）评价ATO和抗微管药物紫杉醇（Paclitaxel，PTX）联合作用于恶性淋巴细胞的研究发现，ATO和PTX在低浓度下能协同诱导细胞有丝分裂阻滞，促进周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）失活以及增强纺锤体检查点。黄然欣等［2］报道，ATO和阿霉素（adriamycin，ADM）单药及两种药物联合在体外均可抑制淋巴瘤细胞增殖，ATO 1、2 μmol/L与ADM 0.5 mg/L联合作用48 h后，对Raji细胞生长的抑制率分别为 （57.9±2.1）%、（69.7±2.3）%，与单药组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05），并表现出药物浓度与作用时间的正相关性。联合用药组较ATO和ADM在同一浓度下单药组相比，细胞凋亡率显著增加，分别为37.53%和50.72% （P＜0.05）。而且，联合组还能显著下调突变型p53 mRNA的表达水平，表明协同抗淋巴瘤作用机制可能与下调突变型p53的表达有关。张红娟［3］发现，ATO和吉西他滨（gemcitabine，GEM）单药以及联合作用均可促进荷鼠源性T细胞淋巴瘤细胞株EL-4细胞的凋亡，且低浓度下两药联合时，细胞凋亡率明显增加。

1.2 通过线粒体途径诱导凋亡 复方黄黛片是以雄黄为君药，青黛和太子参为臣药而组成的中药复方制剂，已证实其有显著的治疗APL效果。雄黄和青黛的有效活性成分分别是硫化砷（arsenic disulfide，As2S2或As4S4）和靛玉红（indirubin）。王玲［4］报道，靛玉红本身对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞株LY1和LY8无抑制增殖和诱导凋亡作用，但可增强As2S2对该细胞株的促凋亡作用，因此As2S2是作为君药，而靛玉红是作为臣药来发挥抗肿瘤活性的。靛玉红增强As2S2对DLBCL细胞株的促凋亡作用可能是通过线粒体凋亡途径，并伴随着Bax断裂。

1.3 抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，主要通过线粒体途径来抑制凋亡，而抑制凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达参与了治疗作用。

青蒿琥酯（Artesunate，ART）能明显抑制DLBCL细胞增殖及诱导细胞凋亡。其机制与下调Myc和抗凋亡的Bcl-2家族蛋白有关。Holien等［5］发现，抗疟疾等同剂量约10 μmol/L的青蒿琥酯即能达到明显的抗淋巴瘤效果。国内研究发现［6］，ART能显著抑制Raji、Jurkat细胞的增殖，低质量浓度ART（0.1μg/m L和0.05μg/mL）与长春新碱（vincristine，VCR，0.01μg/mL和0.005μg/mL）和阿糖胞苷（arabinocytidine，Ara-C，0.1μg/mL和0.01μg/m L）联合，能分别增加VCR、Ara-C对Raji、Jurkat细胞的细胞毒作用。另外，ART还显示出诱导凋亡和降低线粒体跨膜电位的作用机制。

棉酚（gossypol）是从锦葵科植物棉花中分离得到的一种黄色多酚类化合物，是一种天然的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子抑制剂，能阻断其与促凋亡蛋白Bax、Bak、Bad等形成异二聚体，抑制Bcl-2/Bcl-XL的抗凋亡作用，下调Cyclin D1，阻止细胞周期的进程，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。李志铭［7］发现，棉酚与常规化疗药物 ADM、VCR、依托泊苷（etoposide，VP16）、PTX对非霍奇金淋巴瘤细胞具有协同作用。Paoluzzi等［8］报道，左旋棉酚（1-10μmol/L）可增加过表达Bcl-2、Mcl-1的B细胞淋巴瘤对化疗药物来那度胺（carfilzomib）、VP16、ADM和4-羟基环磷酰胺（4-hydroxycyclophosphamide，4-HC）的疗效。程玮［9］发现，醋酸棉酚 （10μmol/L）与地塞米松联合使用可增强地塞米松诱导凋亡的效应。

张明宛等［10］发现，和厚朴酚 （honokiol，HNK）联合吉西他滨具有协同抑制Raji细胞增殖并诱导其凋亡的作用。GEM在2 nmol/L浓度下处理24 h时的抑制率为（7.3±1.5）%，而HNK在60μmol/L浓度下的抑制率为（31.1±0.6）%，两者联合使用时，抑制率可达 （54.2± 1.2）%。其协同机制可能与两药联合后更多细胞发生G0/ G1期阻滞，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活化有关。

Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关［11］。钱敏飞等［12］报道，Survivin在鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的基因表达上调，并与p53高表达密切相关，但与Bcl-2蛋白无明显关联。

张明智等［13-14］观察经醇煎法制成的夏枯草提取物（Prunella vulgaris extract，PVE）联合紫杉醇、阿霉素、顺铂（cisplatin，DDP）、甲氨喋呤（methotrexate，MTX）、长春新碱、阿糖胞苷6种化疗药物对人淋巴瘤Raji细胞株增殖和细胞周期的影响。结果表明，夏枯草提取物在10 μg/mL质量浓度下能明显增强PTX和DDP对Raji细胞的抑制作用；对ADM的增敏作用在低浓度时表现明显，而对Ara-c的增效作用则表现在较高浓度；但PVE对MTX和VCR均无明显的增强抑制作用。刘新奎等［15］报道，PTX及与PVE联合作用于Raji细胞48 h后，均可见典型的亚二倍体凋亡峰。PVE能加强PTX对Raji细胞的作用，与PTX单用比较，PVE与PTX联合组中的S期细胞数下降，G2～M期细胞数升高。PVE作用于Raji细胞后，Survivin蛋白表达减弱，Caspase-3蛋白表达增强，并通过激活JNK信号转导通路，抑制Akt通路激活。

1.4 下调PI3K/Akt/mTOR信号通路 黄芩（Scutellaria baicalensis）的主要黄酮成分黄芩苷（baicalin）与一些化疗药物，如VP16、ADM和柔红霉素（daunorubicin，DNR）联用时，具有体外协同抗人Burkitts淋巴瘤CA46细胞的作用，而且与VP16联用时，还具有协同CA46细胞裸鼠异种移植瘤的作用。另外，30 mg/kg黄芩苷和2 mg/kg VP16联合使用时，对CA46细胞裸鼠异种移植瘤的抑制率为60.4%，高于单用4 mg/kg VP16阳性对照组的51.1%和单用60 mg/kg黄芩苷组的46.7%，其机制可能与诱导凋亡与下调PI3K/Akt/m TOR信号通路有关［16-17］。

1.5 抗耐药作用 肿瘤细胞存在复杂的耐药机制，如多药耐药基因1编码的P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽氧化还原解毒作用、肝细胞色素P450活性上调、拓扑异构酶Ⅱ突变等。

黄芩另一主要成分汉黄芩素（wogonin）能与VP16协同诱导Jurkat和HL-60细胞凋亡［18］。Enomoto等［19］发现，Wogonin协同VP16介导的肿瘤细胞凋亡作用与典型的P-糖蛋白抑制剂维拉帕米和环孢素A相同，其他P-gp底物，如ADM和VCR则无此协同作用。Lee等［20］报道，它能抑制P-gp底物钙黄绿素（Calcein）的排泄，减少细胞内放射性标记VP16的排泄，表明Wogonin可能抑制P-gp和增加VP16在细胞内的蓄积。

范可尼贫血（faneoni anemia，FA）是一种具有肿瘤倾向的罕见遗传性疾病，由调节DNA损伤的FA（FA/ BRCA）通路蛋白系列基因突变引起。姜黄素 （curcum in）是中药姜黄的主要成分，能选择性地抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。它通过抑制FA/BRCA途径中的FANCD2单泛素化，从而逆转细胞对化疗药物的耐药性。肖晖等［21］发现，姜黄素与环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）协同作用时，其介导的FA/BRCA途径受到抑制，5μmol/L浓度下的姜黄素与10μmol/L浓度下的CTX联合使用时，对耐药细胞株HT/CTX的诱导凋亡作用增强，而CTX单药则无此效应，FA/BRCA途径也不受到抑制。

另外，吴秋玲等［22］报道，FN/β1整合素参与调节Raji细胞对阿霉素的敏感性，而姜黄素可能通过下调整合素的表达来抑制FN/β1整合素途径的激活，从而增加Raji细胞株对化疗药物的敏感性。

2 与靶向药物联合的协同机制

单克隆抗体利妥昔单抗（rituximab）是特异性靶向CD20抗原及对B细胞淋巴瘤的标准抗癌药物。利妥昔单抗能增加恶性B细胞淋巴瘤对青蒿琥酯诱导凋亡的敏感性，它和青蒿琥酯都通过外源性和线粒体途径诱导Ramos细胞凋亡，增强Fas/CD95和活性氧（ROS）的表达，下调凋亡调节基因的上游调控因子YY1和SP1。Sieber等［23］发现，利妥昔单抗可下调抗氧化基因表达，从而增强青蒿琥酯的ROS的诱导凋亡作用。

蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib，BTZ）被批准用于多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）的一线治疗和套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）的二线治疗。青蒿琥酯与BTZ均能明显抑制Jurkat细胞增殖，表现为凋亡形态学改变。陈均法等［24］报道，青蒿琥酯与BTZ联合组的抑制率显著高于硼替佐米单药组 （P＜0.01），而且药物联合作用均呈协同方式。

章馨允［25］研究发现，人参皂苷Rh2（G-Rh2）单药作用于T-NHL细胞系HUT-78时，其抑制细胞增殖作用不明显，BTZ和氟达拉滨（Fludarabine，FLU）联合使用时亦然，但两者与G-Rh2（40μmol/L）联合使用时，能明显提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性，而且三药联合后，抑制细胞核因子NF-kB通路作用最强。

何毅等［26］报道，小剂量亚砷酸联合BTZ能更有效地诱导Raji细胞凋亡，并呈现出协同作用，表现为Caspase-3、BAX和IκB-α表达增加，而Bcl-2和JNK2表达量下降。由此推测，该作用可能是通过抑制NF-κB和JNK2通路实现的。

套细胞淋巴瘤是B细胞非霍奇金淋巴瘤中预后较差的一个亚型，对大多数化疗药物有抗药性。ATO可减少MCL细胞Cyclin D1和NF-kB的表达，促进细胞凋亡，并能显著提高BTZ对MCL细胞增殖的抑制作用，是理想的硼替佐米增敏剂［27］。

3 与细胞因子联合的协同机制

成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）是一种活化的成熟T细胞恶性增生性疾病，与逆转录病毒HTLV-1的持续感染有关，使用常规化疗效果十分有限。目前，干扰素-α（IFN-α）是应用于临床治疗的最重要的细胞因子之一，它与ATO的联合使用已被证明在体外有诱导HTLV-1感染的T细胞凋亡的作用［28］，其机制可能与上调IκB-α的产生导致RelA（p65）结合NF-κB复合物下降有关［29］。

吴青等［30］发现，IFN-α与姜黄素联合应用可显著抑制Raji细胞的生长，诱导细胞发生凋亡，两者具有协同效应。凋亡蛋白caspase6、caspase8、caspase9表达显著增高，呈现出明显的量效与时效关系。

4 讨论

恶性淋巴瘤是源于淋巴瘤系统的恶性肿瘤，Bcl-2家族等凋亡相关基因及其表达产物异常，以及相应的调控增殖细胞内信号传导通路的激活是其主要分子病理机制。中药天然成分，如砷剂 （ATO、雄黄等）、多酚类 （黄芩、棉酚、姜黄素等），三萜类 （夏枯草等）、皂苷类 （人参皂苷Rh2等）在体外研究中都显示出较好的诱导淋巴瘤细胞凋亡的活性，与化疗药物及生物制剂联合协同作用明显，具有良好的应用前景。

这些天然药物主要为传统中药中的清热解毒、化痰攻毒和补益药，符合临床以毒攻毒、扶正祛邪的中医治则。其机制主要为干扰细胞增殖周期，抑制抗凋亡基因及相关蛋白分子（Bcl-2、survivin）表达，从线粒体途径来促进肿瘤细胞凋亡，抑制PI3K/Akt/mTOR、JNK、NF-κB等信号肿瘤增殖相关转导通路。化疗药物侧重于细胞毒作用，而中药则侧重于对细胞凋亡的诱导和细胞增殖的干扰，联合使用能进一步抑制DNA合成，增强化学损伤，并干扰其损伤修复进程。另外，中药成分中的姜黄素可抑制FN/β1整合素，而黄芩素则可抑制P-gp等耐药途径，有助于化疗药物在细胞内蓄积，减缓药物排泄，从而增加药物敏感性。

中药天然成分不仅与化学药物，如紫杉醇、阿霉素、顺铂、依托泊苷、甲氨喋呤、长春新碱、阿糖胞苷、氟达拉滨等联用有显著的增效作用，还与蛋白酶体抑制剂 （硼替佐米）、单克隆抗体 （利妥昔单抗）、α-干扰素等生物制剂同样显现出良好的协同作用。这些实验研究结果反映了中药成分具有独特的作用机制，以及对肿瘤细胞的多靶点复杂调控。

然而，由于目前实验研究还存在很大的局限性，往往只能揭示作用机制中的一个或几个环节，很难找到最关键的真正调控对象和协同机制，因此还不具备很强的说服力，其协同作用也需要临床研究的进一步证实。

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R966

：A

：1001-1528（2015）07-1544-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.032

2014-04-11

上海市科学技术委员会引导项目 （中医）（12401906100）

朱伟嵘 （1970—），男，硕士，副主任医师，从事中医药防治肿瘤研究。Tel：（021）64370045-601068；E-mail：willonzhu@ 163.com

*通信作者：沈小珩 （1956—），女，博士，主任医师，博士生导师，从事中医药防治肿瘤研究。Tel：（021）64370045-601068；E-mail：meilixling@163.com